稳定表达EGFP-LC3蛋白SH-SY5Y细胞系的构建

目的:建立稳定表达微管相关蛋白1轻链3(microtubule associated protein 1 light chain 3,LC3)与绿色荧光蛋白(EGFP)形成的融合蛋白(EGFP-LC3)的人神经母细胞瘤株SH-SY5 Y细胞系,验证EGFP-LC3点状聚集物能够实时直观地反映自噬小体和自噬流.方法:以人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞)的cDNA为模板,克隆LC3,并连接EGFP绿色荧光蛋白.将EGFP-LC3连接入慢病毒载体GV348中,构建慢病毒表达载体EGFP-LC3-GV348.慢病毒转染人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5 Y细胞),使用3μg/mL嘌呤霉素筛选并处理细胞1月,筛选得到EGFP-LC3稳转系.诱导自噬后,用共聚焦显微镜观察LC3荧光斑点并定量分析.Western blot检测目的蛋白表达情况.结果:经酶切证实,EGFP-LC3-GV348慢病毒表达载体构建正确.在激光共聚焦显微镜下,可以观察到细胞内的绿色荧光EGFP代表的自噬小体,活体染料LysoTracker Red DND-99将溶酶体染成红色荧光,红色荧光与绿色荧光重叠代表自噬溶酶体.无血清诱导自噬后,自噬小体(绿色荧光斑点)明显增加,差异有统计学意义(P<0.001).Western Blot免疫印迹可见EGFP-LC3融合蛋白表达条带.结论:成功构建了稳定表达EGFP-LC3的SH-SY5 Y细胞系,EGFP-LC3荧光斑点可以直观实时反映自噬囊泡,为进一步探讨神经退行性疾病的自噬机制提供了实验基础.     

多节段背根节慢性压迫大鼠的机械触刺激和冷刺激诱发痛行为

目的:脊椎间盘突出、椎间孔狭窄、脊髓损伤以及肿瘤造成的背根节(dorsal root ganglion,DRG)及其邻近神经根的机械性压迫可能是引起腰背痛与坐骨神经痛的重要原因.临床上多节段神经根性痛比单一神经根性痛更常见,患者表现出多节段神经根压迫和多节段椎间孔狭窄.为此,本实验观察了多节段DRG慢性压迫大鼠的痛行为.方法:实验在本室创建的大鼠背根节慢性压迫(chronic compression of DRG,CCD)模型基础上采用单侧L3-5多节段DRG慢性压迫模型,应用von Frey细丝和丙酮分别检测机械触刺激诱发痛阚值和冷刺激诱发痛反应级别及反应百分数.结果:多节段DRG慢性压迫大鼠表现明显双侧机械触刺激诱发痛和冷刺激诱发痛行为,伴随明显延迟的对侧机械触刺激和冷刺激诱发痛的镜像痛行为.组织学观察显示多节段DRG慢性压迫同侧DRG内部及其神经根有明显炎症反应.结论:机械性压迫和炎症共同作用神经根和DRG导致多节段DRG慢性压迫大鼠明显的机械触刺激诱发痛和冷刺激诱发痛行为.     

5-Aza-cdR通过DNA甲基化调节BDNF参与学习记忆的机制

目的:研究5-氮-2'脱氧胞苷(5-Aza-cdR)通过影响DNA甲基转移酶功能,调节BDNF表达并参与学习记忆的相关机制.方法:以70只6～8周18～22克雄性ICR小鼠为研究对象,随机分为三组:注射PBS为C组,25只;注射5-Aza-cdR为注射组,30只;注射K252a为K252a注射组,15只.通过Western blot、real-time PCR、免疫荧光技术,检测小鼠海马脑区DNA甲基转移酶3B(DNMT3B)和脑源性神经营养因子(BDNF)在mRNA和蛋白水平的表达变化,通过水迷宫实验检测小鼠的学习记忆能力.结果:与C组比较,小鼠经过5-Aza-cdR处理24 h后,DNMT3B的蛋白水平和mRNA水平均有所下降(P<0.05),BDNF的蛋白和mRNA水平显著增加(P<0.05).与C组比较,5-Aza-cdR注射组的BDNF荧光强度显著增强(P<0.05),小鼠找到目标平台的潜伏期显著降低(P<0.05),目标象限百分比以及目标象限穿越次数均显著增加(P<0.05).结论:5-Aza-cdR下调DNMT3B表达后,通过上调小鼠海马中BDNF的表达,可提高小鼠的学习记忆能力.     

低氧预适应对小鼠海马神经元中TSC1表达的影响

目的:在体视显微镜下分割ICR小鼠海马CA1区和CA3区,研究结节性硬化症因子1(TSC1)在小鼠海马低氧中的神经保护作用。方法:ICR小鼠分为对照组(control)、低氧对照组(hypoxia)及低氧预适应组(HPC),在体视显微镜下观察海马形态并分割CA1区和CA3区;采用real time RT-PCR和Western Blot的方法分别检测小鼠海马组织TSC1 mRNA和蛋白的表达;采用免疫荧光检测小鼠海马组织TSC1荧光强度。结果:大脑冠状切片清晰显示出海马CA1区、CA3区和DG区;CA1区TSC1 mRNA在低氧组降低而在低氧预适应组增高;Western Blot和组织免疫荧光显示:与对照组相比,低氧预适应组CA1区TSC1表达增加;而CA3区TSC1在低氧组和低氧预适应组均增加。结论:TSC1的差异性表达可能提示TSC1可能参与了低氧预适应对低氧敏感的CA1区神经细胞的保护。     

多节段背根节慢性压迫大鼠机械触刺激诱发痛镜像痛的外周机制

目的:研究多节段背根节慢性压迫(chronic compression of multiple dorsal root ganglia,CCD)大鼠机械触刺激诱发痛镜像痛的外周机制。方法:制作单侧L3-L5 CCD模型大鼠,并应用von Frey filaments检测双侧机械触刺激诱发痛行为,利用免疫组织化学方法检测该模型大鼠同侧及对侧DRG大中型和小型神经元中与痛觉信息传递相关的神经肽-降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)的表达情况。结果:CCD大鼠表现出明显双侧机械触刺激诱发痛行为;免疫组织化学结果显示,CCD模型大鼠同侧及对侧DRG大和中等大小神经元内,CGRP的表达与正常组大鼠DRG神经元比较有明显升高(P<0.05),而同侧及对侧DRG小神经元,CGRP的表达与正常组大鼠DRG神经元比较无明显变化(P>0.05)。结论:CCD模型大鼠双侧DRG内传递痛觉信息的神经肽CGRP表达升高,提示外周双侧DRG神经元内CGRP的可塑性变化可能参与多节段CCD模型大鼠机械触刺激诱发痛镜像痛的发生。     

蒙药额尔敦-乌日勒对心肌损伤的修复作用及机制探讨

目的:观察蒙药额尔敦-乌日勒对斑马鱼心脏损伤后再生作用及其可能作用机制，验证其治疗的有效性，为进一步研究蒙药额尔敦-乌日勒提供实验依据。方法:利用转基因鱼系Tg(vmhc:mCherry-NTR)经甲硝唑(MTZ)处理后建立心室损伤模型，把90只受精3 d(3 dpf, days post fertilization)的斑马鱼胚胎随机分为对照组(DMSO,n=30)和心肌消融组(MTZ,n=30)以及心室损伤后额尔敦-乌日勒治疗组(MTZ+EW,n=30),治疗组在MTZ处理后24 h(24 hpt, 24 hour post treatment)用蒙药额尔敦-乌日勒混悬液以25μg/mL治疗。3组在72 hpt检测细胞增殖，用共聚焦显微镜观察细胞增殖情况并定量分析，同时应用RT-qPCR分析一氧化氮合酶(NOS)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)的表达量。结果:治疗组斑马鱼胚胎经过蒙药额尔敦-乌日勒治疗后，心肌损伤后的再生修复比例明显上升，且再生心肌细胞的增殖速度较对照组加快、炎症因子表达量明显...     

miR-103及其靶基因Cav1.2在低氧预适应提升小鼠学习记忆中的表达

目的:探究miR-103和Cav1.2在低氧预适应改善学习记忆能力中的表达变化，阐明miR-103调控Cav1.2在低氧预适应内源性神经保护中的作用机制。方法:使用ICR雄性小鼠作为实验对象，构建正常组(Control)、低氧组(Hypoxia)、低氧预适应组(HPC),通过Morris水迷宫分别评估各组小鼠的学习记忆能力；通过Real-time PCR和Western bolt技术检测小鼠海马组织中miR-103和Cav1.2的表达变化，通过双荧光素酶报告基因检测miR-103和Cav1.2之间的调控关系。结果:小鼠随着低氧次数的增加，低氧耐受时间显著增强。与Control组相比，HPC组小鼠的潜伏期时间明显降低(P<0.05),目标象限时间的百分比增加(P<0.05),平台穿越次数明显增加(P<0.05)。与Control组相比，HPC组小鼠海马组织中miR-103在第1 d表达下调(P<0.000 1)。miR-103-3p通过与Cav1.2的3’UTR结合从而靶向Cav1.2。与Control组相比，HPC组小鼠海马组织中Cav1.2蛋白在第2 d表达升...