多重实时定量PCR检测G1—G4型轮状病毒方法探索

 目的  对多重实时定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）进行反应体系筛选和方法探索，使其用于G1—G4型轮状病毒VP7基因的快速分型和定量分析。方法  设计G1—G4型轮状病毒VP7基因特异性引物和探针，以特异性体外转录RNA为模板，筛选多重qPCR反应体系，建立多重qPCR方法。采用单因素方差分析和配对样本t检验对多重与单重qPCR检测结果进行比较。结果  经筛选，得到6组三重qPCR反应体系和1组四重qPCR反应体系。所建立的三重和四重qPCR中，除四重qPCR的G1型参数〔标准曲线决定系数（R²）为0.982、扩增效率为89.221%〕略低于要求外，G2—G4型的标准曲线R²均＞0.99，扩增效率均在90%至110%之间；检测灵敏度达102拷贝/μl。多重与单重qPCR检测同一样本的相关性较好（R²＞0.95）。三重与单重qPCR（t值为1.420~25.786，P值均>0.05）、四重与单重qPCR（t值为2.505~4.851，P值均>0.05）检测结果间的差异均无统计学意义。结论   建立的多重qPCR可同时对3种以上目的基因进行分型和定量检测，为未来多价轮状病毒疫苗及混合病毒样本中毒株的快速分型和定量检测方法的建立提供了借鉴。     

新建主细胞库对水痘减毒活疫苗质量影响的分析

目的 基于细胞基质分析新建人二倍体细胞MRC-5主细胞库,并通过主细胞库变更前后所制的水痘减毒活疫苗（水痘疫苗）可比性研究,分析新建主细胞库对水痘疫苗质量和稳定性的影响。方法 对新建MRC-5主细胞库、工作细胞库和生产终末代细胞按照中国药典2015年版和企业质量标准进行抽样检定,并传代至超高代次细胞进行传代稳定性研究,对比细胞生长与细胞计数。用新建主细胞库连续试生产3批水痘疫苗并进行工艺验证,分析疫苗原液及成品的质量结果,并考察水痘病毒基因序列和产品稳定性。结果 新建主细胞库、工作细胞库及其他各代次细胞在传代过程中生长良好,细胞计数正常,检定结果均符合质量标准。试生产的水痘疫苗工艺合格,变更前后生产的疫苗水痘病毒基因序列无差异;病毒滴度均为4.0 lg噬斑形成单位（plaque-forming unit,PFU）/0.5 ml,热稳定性试验结果均为3.4 lgPFU/0.5 ml,水分含量均不高于1.5%,符合企业注册标准;质量稳定性趋势基本一致。结论  建立的人二倍体细胞MRC-5主细胞库各项检定结果合格。用新细胞库试生产的水痘疫苗质量和稳定性与变更前的一致。     

器官移植受者接种麻疹、腮腺炎、风疹系列疫苗的有效性和安全性研究

器官移植受者术后易于感染许多疫苗可预防疾病,存在预后不良的风险,甚至可因严重感染而威胁生命。接种麻疹、腮腺炎、风疹（麻腮风）系列疫苗能有效降低器官移植受者术后的麻疹、腮腺炎和风疹发病率。此文综述了器官移植受者接种麻腮风系列疫苗的有效性和安全性,以期为器官移植受者制定个性化麻腮风系列疫苗免疫接种程序提供参考。     

皮内注射用卡介苗关键质量指标关联性分析

目的  对皮内注射用卡介苗（卡介苗）关键质量指标进行关联性分析,为生产工艺控制提供一定的依据。方法  用统计软件（Minitab 17和SPSSAU）对211批卡介苗的菌种代次、半成品沉降率、半成品活菌数、成品活菌数、成品效力和成品渗透压摩尔浓度等关键质量指标进行统计分析,探寻各指标间相互影响的规律。结果  第6、9和12代卡介菌生产的卡介苗成品活菌数均值分别为5.07×10⁶、5.49×10⁶和6.02×10⁶ 菌落形成单位（colony-forming unit,CFU）/mg,Pearson相关系数为0.200（P<0.05）,成品活菌数随卡介苗生产用菌种代次的升高而略有增加。半成品沉降率处于0.00%~7.99%、8.00%~12.00%和12.00%~20.00%的卡介苗成品活菌数均值分别为5.57×10⁶、5.52×10⁶和5.06×10⁶ CFU/mg,Pearson相关系数为-0.182（P<0.05）,成品活菌数随半成品沉降率提高而略有降低。半成品活菌数处于1.00×10⁷~1.99×10⁷、2.00×10⁷~2.99×10⁷和3.00×10⁷~4.00×10⁷ CFU/mg的卡介苗成品活菌数均值分别为4.61×10⁶、5.69×10⁶和6.53×10⁶ CFU/mg,Pearson相关系数为0.537（P<0.05）,成品活菌数随半成品活菌数增加而显著增加。成品活菌数处于1.00×10⁶~3.99×10⁶、4.00×10⁶~5.99×10⁶和6.00×10⁶~8.00×10⁶ CFU/mg的卡介苗成品效力均值分别为17.61、16.51和16.55 mm,Pearson相关系数为-0.187（P<0.05）,成品效力随成品活菌数增加而先略有降低再趋于平稳。成品活菌数处于1.00×10⁶~3.99×10⁶、4.00×10⁶~5.99×10⁶和6.00×10⁶~8.00×10⁶  CFU/mg的卡介苗成品渗透压摩尔浓度均值分别为363.61、363.21和368.68 mOsmol/kg,Pearson相关系数为0.210（P<0.05）,成品渗透压摩尔浓度随着成品活菌数增加而略有升高。结论  在企业标准范围内,成品活菌数受半成品活菌数的影响较大,受菌种代次、半成品沉降率的影响较小。成品活菌数对成品效力和成品渗透压摩尔浓度的影响较小。     

单笼与群居饲养对雌性食蟹猴生理指标的影响

目的 了解单笼与群居饲养雌性食蟹猴生理指标的差异.方法 选取9只4～6岁雌性食蟹猴作为实验对象,前5个月单笼饲养,后5个月群居饲养.对体质量、体温、血常规、血生化、尿常规等生理指标进行测定.采用重复测量方差分析比较两阶段指标是否存在差异.结果 食蟹猴单笼阶段的体质量显著低于群居阶段(P＜0.05).血常规中,单笼阶段的白细胞计数(WBC)、嗜中性粒细胞计数(NEUT)、嗜中性粒细胞百分比(NEUT％)极显著高于群居阶段(P＜0.01);单笼阶段的单核细胞计数(MONO)、单核细胞百分比(MONO％)极显著低于群居阶段(P＜0.01);单笼阶段的淋巴细胞百分比(LYMPH％)显著低于群居阶段(P＜0.05).血液生化中,单笼阶段的总胆红素(TBIL)极显著低于群居阶段(P＜0.01);单笼阶段的天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、甘油三酯(TG)显著高于群居阶段(P＜0.05).单笼阶段的尿常规中的蛋白质阳性率高于群居阶段,组间相比差异显著(P＜0.05).其余指标组间相比无统计学差异.结论 食蟹猴更适合群居饲养,如果长期单笼饲养,可能对其体质量及血液学和尿常规中某些指标产生较大影响.     

麻疹、腮腺炎、风疹、水痘联合减毒活疫苗的生产工艺研究

目的  建立麻疹、腮腺炎、风疹、水痘联合减毒活疫苗（combined live attenuated measles，mumps，rubella and varicella vaccine，MMRV）的生产工艺。方法  根据现有疫苗病毒原液生产工艺，将麻疹病毒沪-191纯化株、腮腺炎病毒S79株、风疹病毒BRD-Ⅱ株和水痘-带状疱疹病毒Oka株在原代鸡胚成纤维细胞或人二倍体细胞MRC-5株中制备高滴度病毒原液，并超低温保存。筛选无明胶冻干稳定剂配方。按国外已上市同类产品的病毒配比，研究MMRV中4种病毒的原液配制滴度及成品配制比例，建立最佳冻干工艺。结果  用筛选出的适合于MMRV的无明胶冻干稳定剂配方进行试验，确定病毒原液的配制滴度为，麻疹4.6 lg半数细胞培养感染量（50% cell culture infective dose，CCID₅₀）/ml、腮腺炎5.8 lgCCID₅₀/ml、风疹4.3 lgCCID₅₀/ml、水痘4.8 lg噬斑形成单位（plaque forming unit，PFU）/ml。使成品中腮腺炎病毒滴度至少达到麻疹和风疹和水痘病毒的10倍，水痘病毒滴度高于现有单价水痘疫苗。连续制备3批MMRV，平均病毒滴度为，麻疹4.5 lgCCID₅₀/ml、腮腺炎5.1 lgCCID₅₀/ml、风疹4.3 lgCCID₅₀/ml、水痘4.6 lgPFU/ml；平均水分为1.2%。其他项目检定均合格。结论  建立了MMRV的生产工艺，可以稳定生产出达到国外同类产品质量标准并符合我国4种单价减毒活疫苗国家标准的产品。     

国产水痘减毒活疫苗质量分析

目的 对国产水痘减毒活疫苗进行质量分析，判断疫苗的安全性和有效性。方法 取2019年生产的102批水痘减毒活疫苗，进行鉴别试验、外观、pH值、渗透压摩尔浓度、水分、病毒滴定、热稳定性、牛血清白蛋白残留量、抗生素残留量、无菌、异常毒性、细菌内毒素含量的检查。结果 各项检查结果均符合《水痘减毒活疫苗制造与检定规程》和中国药典2015年版三部相关要求，病毒滴定和热稳定性试验结果均在3.4 lg噬斑形成单位/0.5 ml以上。结论  国产水痘减毒活疫苗是安全有效的。     

Sabin株脊髓灰质炎病毒灭活疫苗的制备及免疫原性评价

目的  建立Sabin株毒种制备脊髓灰质炎灭活疫苗（inactivated poliovirus vaccine, IPV）生产工艺并评价其免疫原性。方法  采用Vero细胞培养Sabin株脊髓灰质炎Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型病毒,制备3价Sabin株IPV（Sabin strain IPV, sIPV）。通过ELISA检测D抗原含量。检测病毒滴度,电子显微镜下观察纯化病毒形态并电泳鉴定,分析抗原纯度,同时检测纯化原液宿主细胞残余DNA和蛋白含量。通过大鼠体内接种法比较sIPV和野生株IPV免疫原性,并观察中和抗体滴度变化。结果 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型收获液D抗原含量分别为2 437、365、1 253 DU/ml,病毒滴度分别为每毫升8.4 、7.8和7.9 lg半数细胞培养物感染量。纯化病毒抗原纯度均﹥99%。电子显微镜下观察可见直径20~30 nm病毒颗粒,电泳鉴定正确。纯化原液的残余宿主细胞DNA和蛋白含量分别12.3 pg/500 μl和9.8 ng/ml。sIPV 3针免疫后在大鼠体内诱导产生抗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型中和抗体的几何平均滴度分别为9 397.8、554.7和4 668.4,与野生株IPV相比Ⅰ型明显增高（t=-3.429,P=0.004）,Ⅱ、Ⅲ型无明显差别,初免后19周内均维持在较高水平。结论 建立了稳定的sIPV生产工艺,制备的sIPV免疫原性较好。     

卡介菌多糖核酸治疗口腔扁平苔藓有效性和安全性的荟萃分析

目的   荟萃分析卡介菌多糖核酸治疗口腔扁平苔藓的有效性和安全性。方法   检索美国医学文献数据库、Embase、Cochrane图书馆、万方数据库、维普数据库、中国期刊全文数据库、中国生物医学文献数据库、中国临床试验注册中心、美国临床试验注册中心,搜集卡介菌多糖核酸与非卡介菌多糖核酸比较治疗口腔扁平苔藓的临床随机对照试验。筛选文献和提取有效数据后,根据Jadad质量评分法对纳入荟萃分析的文献进行评分。采用STATA 15.0统计软件进行荟萃分析、敏感性分析和发表偏倚分析。结果   6篇文献符合纳入标准,共计484例患者。荟萃分析结果显示卡介菌多糖核酸治疗组（试验组）总有效性优于非卡介菌多糖核酸治疗组（对照组）（优势比＝2.29,95％置信区间：1.57~3.35,P<0.05）,复发率低于对照组（相对危险度＝0.50,95％置信区间：0.32~0.79,P<0.05）,差异具有统计学意义。两组均无严重不良反应发生,且发生不良反应例数无统计学差异（相对危险度＝0.57,95％置信区间：0.19~1.71,P＞0.05）。Begg’s 检验结果显示未存在明显发表偏倚。结论  卡介菌多糖核酸治疗口腔扁平苔藓的临床效果优于对照组,且尚无严重不良反应发生,临床上值得推广应用。