乙型脑炎减毒活疫苗检定用BHK21工作细胞库的质量控制

目的  对乙型脑炎减毒活疫苗（乙脑疫苗）检定用BHK21工作细胞库进行全面质量控制以确保其质量。方法  按照《中华人民共和国药典》2010年版三部收录的细胞鉴别试验、无菌检查、支原体检查、外源病毒污染检查和病毒敏感性检查方法,对检定用BHK21工作细胞库进行全面质量检定。结果  待检BHK21细胞的同工酶电泳图谱与BHK21细胞标准图谱一致。细菌、真菌、支原体、外源病毒检测结果均符合规定要求。病毒敏感性检测显示,待检BHK21细胞培养的乙脑疫苗病毒滴度为6.93 IgPDF/ml,与合格BHK21细胞培养的乙脑疫苗（病毒滴度为6.89 IgPDF/ml）相似,均达到质量标准要求（6.48~7.12 IgPDF/ml）。结论 合格的BHK21工作细胞库可用于乙脑疫苗的质量检定来保证乙脑疫苗质量。     

水痘-带状疱疹病毒Oka疫苗株与野毒株序列比对

目的 观察水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)Oka疫苗株(V-Oka株)的传代稳定性,并与分离于水痘患者的野毒株进行序列比对.方法 将V-Oka株在人二倍体细胞MRC-5中连续传代培养至50代,提取32、34、38、42、46和50代V-Oka株及野毒株的DNA,对主要基因(OR...     

水痘疫苗生产工艺变更前后Oka株病毒基因序列及疫苗质量分析

目的 通过对采用细胞工厂工艺进行细胞培养前后的Oka株病毒基因序列和水痘疫苗质量进行分析比较,评价生产工艺变更对水痘疫苗质量的影响.方法 从水痘疫苗原液提取病毒DNA,采用PCR法扩增片段,通过对PCR产物测序或克隆质粒测序并拼接,获得Oka株的病毒全基因序列,并与GenBank中相关序列比对.对工艺变更前后生产的疫苗进行病毒滴度、牛血清白蛋白残留量和抗生素残留量比较.结果 工艺变更前后的疫苗病毒基因序列一致;检测到33个单核苷酸多态性位点为亲本型和减毒型碱基共存,具有典型的Oka株特征;没有发现GenBank未登录或文献未报道的新突变.工艺变更前后生产疫苗平均病毒滴度分别为5.00和5.02 lg蚀斑形成单位/ml,两者间的差异无统计学意义(t=1.1,P=0.26),且各项关键指标均符合企业标准和药典要求.结论 将细胞工厂引入生产工艺后,水痘疫苗具有与原工艺生产的制品相似的安全性和质量一致性.     

水痘疫苗的研制和临床评价

减毒活疫苗株的建立利用原代人胚肺细胞于1970年12月7日从1例患典型水痘的3岁男孩的水疱液中分离到水痘—带状疱疹病毒(Oka 株)。为获得减毒株,将病毒在人胚肺细胞中34℃连续培养,并在豚鼠胚纤维母细胞中传代。由于后者是目前发现的唯一对水痘—带状疱疹病毒敏感的非灵长目动物细胞,故认为通过此细胞获得宿主依赖性水痘—带状疱疹病毒变异株是合适的。然后,此病毒经蚀斑纯化,并在WI38和MRC-5人二倍体细胞中传几代后,制成实验性疫苗。     

冻干人用狂犬病疫苗(MRC-5细胞)非临床安全性研究

目的 对冻干人用狂犬病疫苗(MRC-5细胞)进行全身主动过敏试验、肌肉刺激性、单次给药毒性和溶血性评价,以考察其安全性.方法 本研究起止时间为2014年3月至2016年10月.按照确定的工艺和质量标准,使用人二倍体细胞MRC-5培养狂犬病固定毒株,灭活、纯化后制备冻干人用狂犬病疫苗,质量检定合格后,用于开展全面的动物毒...     

用细胞培养克隆方法研制新型天花疫苗

作者对 Dryvax痘苗病毒完成了细胞培养克隆传代和纯化 ,并对所选克隆毒株进行了一系列动物试验 ,进而在志愿者中作了疫苗免疫临床观察。　　天花疫苗 Dryvax株 ,经 MRC- 5人胚肺二倍体细胞连续 3代次噬斑纯化 ,选出 6个克隆株痘苗病毒再经 MRC- 5细胞传 5代 ,用于制备试验性疫苗。同时对 MRC- 5细胞小剂量接种病毒传 3代获得 1株多克隆毒种。　　对 7个新毒株与 Dryvax疫苗原株作了家兔皮内和乳鼠脑内神经毒力及病毒滴度比较 ,结果克隆 2号株因其免疫的家兔皮肤病变小、乳鼠存活率高、乳鼠脑内病毒滴度低、其他减毒表型与 Dryvax疫苗…     

水痘减毒活疫苗生产工艺研究

目的:比较细胞工厂和方瓶两种培养方式所生产水痘疫苗的产量及质量。方法:使用细胞工厂和方瓶培养2BS细胞,长成致密单层后接种水痘-带状疱疹病毒OKa株,待细胞病变达70%以上时,用EDTA消化、洗涤离心收集病变细胞,加入保护剂-65℃以下保存,检定合格后进行超声、澄清制备原液和半成品,转分装冻干制成。结果:使用细胞工厂和方瓶获得的水痘疫苗原液及成品的各项检定结果均符合本企业《水痘减毒活疫苗注册标准》的要求。结论:细胞工厂大大减少了厂房占用面积,提高了疫苗产量,保证了疫苗生产过程的质量可控性和稳定性,适用于水痘疫苗的规模化生产。     

麻疹、腮腺炎、风疹和水痘联合减毒活疫苗的研制

目的 建立麻疹、腮腺炎、风疹和水痘(measles,mumps,rubella and varicella,MMRV)联合减毒活疫苗的生产工艺和检定方法.方法 采用麻疹病毒沪-191株、腮腺炎病毒S79株、风疹病毒BRDⅡ株、水痘-带状疱疹病毒北京84-7株,在原代鸡胚细胞或人胚肺二倍体细胞2BS株中制备高滴度疫苗病毒原液.观察4种原液按不同比例稀释配制后病毒的滴度变化和相互干扰现象,确定MMRV疫苗中4种原液的配制比例,并筛选适宜保护剂,建立最佳冻干工艺.同时,建立MMRV联合减毒活疫苗的检定方法.采用t检验对结果进行比较.结果 选择最佳配制比例、保护剂和冻干工艺制备出连续多批MMRV疫苗,按国家药典要求检定全部合格.其中连续3批疫苗经国家检定机构检定合格:麻疹病毒基础滴度和37℃放置7d后的滴度分别≥3.9和≥3.5 lg半数细胞培养感染量(50％ cell culture infective dose,CCID50)/ml,腮腺炎病毒≥5.0和≥4.7 lgCCID50/ml,风疹病毒≥5.0和≥4.8 lgCCID50/ml,水痘病毒≥4.5和≥4.4 lg噬斑形成单位/ml.用建立的方法检测MMRV疫苗,结果4种病毒滴度实测值与理论值之间的差异无统计学意义(t值为0.149～1.838,P值均＞0.05).结论 建立了稳定、可行的MMRV疫苗生产工艺和检定方法.     

细胞工厂在水痘疫苗生产中的应用

目的:提高水痘疫苗产量和厂房的利用率。方法:采用细胞工厂培养MRC-5细胞,以Roux瓶培养作对照,比较两种工艺的细胞生产情况、原液收获量等,并进行各项检定。结果:在同样细胞复苏量的条件下,采用细胞工厂比Roux瓶工艺生产的水痘疫苗产量要高,且各项检测指标均合格。结论:利用细胞工厂制备水痘疫苗,不仅提高了疫苗产量,而且节省了培养空间,降低了污染率,可用于水痘疫苗的大规模生产。     

低血清培养基在水痘减毒活疫苗生产中的应用

目的 应用低血清培养基在水痘减毒活疫苗生产过程中进行细胞和病毒培养,观察培养效果,验证其对疫苗生产的适用性。方法 采用低血清培养基培养MRC-5细胞和水痘病毒Oka株,以传统培养基的生产为对照,比较细胞生长、病毒感染情况及原液病毒滴度和牛血清白蛋白残留量。采用t检验对结果进行比较。结果 在相同工作细胞库细胞复苏的情况下,低血清培养基与传统培养基培养的细胞和病毒形态,没有明显的差异。低血清培养基与传统培养基培养得到的水痘病毒原液病毒滴度均为5.0~5.1 lg噬斑形成单位/ml,差异无统计学意义(t=1.00,P>0.05);但低血清培养基生产的水痘病毒原液中牛血清白蛋白残留量(12~19 ng/ml)显著低于传统培养基生产的(39~46 ng/ml)(t=8.51,P<0.05)。结论 在水痘减毒活疫苗生产过程中应用低血清培养基未影响病毒滴度,但牛血清白蛋白残留量明显降低,减少了因牛源性成分引起疫苗不良反应的风险,可提高疫苗质量,适用于水痘减毒活疫苗的生产。     

麻疹、腮腺炎、风疹、水痘联合减毒活疫苗的生产工艺研究

目的  建立麻疹、腮腺炎、风疹、水痘联合减毒活疫苗（combined live attenuated measles，mumps，rubella and varicella vaccine，MMRV）的生产工艺。方法  根据现有疫苗病毒原液生产工艺，将麻疹病毒沪-191纯化株、腮腺炎病毒S79株、风疹病毒BRD-Ⅱ株和水痘-带状疱疹病毒Oka株在原代鸡胚成纤维细胞或人二倍体细胞MRC-5株中制备高滴度病毒原液，并超低温保存。筛选无明胶冻干稳定剂配方。按国外已上市同类产品的病毒配比，研究MMRV中4种病毒的原液配制滴度及成品配制比例，建立最佳冻干工艺。结果  用筛选出的适合于MMRV的无明胶冻干稳定剂配方进行试验，确定病毒原液的配制滴度为，麻疹4.6 lg半数细胞培养感染量（50% cell culture infective dose，CCID₅₀）/ml、腮腺炎5.8 lgCCID₅₀/ml、风疹4.3 lgCCID₅₀/ml、水痘4.8 lg噬斑形成单位（plaque forming unit，PFU）/ml。使成品中腮腺炎病毒滴度至少达到麻疹和风疹和水痘病毒的10倍，水痘病毒滴度高于现有单价水痘疫苗。连续制备3批MMRV，平均病毒滴度为，麻疹4.5 lgCCID₅₀/ml、腮腺炎5.1 lgCCID₅₀/ml、风疹4.3 lgCCID₅₀/ml、水痘4.6 lgPFU/ml；平均水分为1.2%。其他项目检定均合格。结论  建立了MMRV的生产工艺，可以稳定生产出达到国外同类产品质量标准并符合我国4种单价减毒活疫苗国家标准的产品。     

新建人二倍体细胞株国内外研究概况

在病毒疫苗生产中,人二倍体细胞较原代细胞更具优势,可解决原代细胞易受外源污染、稳定性差、抗原性不一致的问题,并可用于建立细胞种子库系统,利于质量控制。目前常用作细胞基质的人二倍体细胞株包括MRC-5、2BS、KMB-17、WI-38以及SV-1等。此文综述了国内外法规对人二倍体细胞株的要求以及质量评价,以促进人二倍体细胞株的建立及广泛应用。     

生产场地变更注册的疫苗质量可比性研究

目的 对水痘减毒活疫苗(水痘疫苗)生产场地变更前后的关键质量指标进行比较,并研究注册研制的监管.方法 国内一家水痘疫苗生产企业的原生产车间、新生产车间同步生产各3批水痘疫苗,进行关键质量指标、稳定性和安全性比较研究.结果 原车间、新车间生产的水痘疫苗关键质量指标、稳定性和安全性比较研究均符合注册标准.新车间与原车间生产的水痘疫苗的水分(1.1％～1.4％、1.1％～1.3％)、病毒滴度(均为3.9～4.0)lg蚀斑形成单位/ml)、牛血清白蛋白残留量(15～18、17～23 ng/ml)、抗生素残留量(0.2～.5、0.4～5.0 ng/剂)相似.结论 生产场地变更未对水痘疫苗质量产生影响,注册监管是有效的.     

预灌封注射器装灭菌注射用水作为水痘减毒活疫苗稀释剂的质量和稳定性研究

目的 研究预灌封注射器装灭菌注射用水(注射器装灭菌水)作为水痘减毒活疫苗(水痘疫苗)稀释剂的质量及稳定性,用以取代原有的安瓿瓶装灭菌注射用水.方法 连续生产并分装3批注射器装灭菌水,依据《中华人民共和国药典》2010年版二部(药典二部)附录XIXC“原料药与药物制剂稳定性试验指导原则”,对注射器装灭菌水的质量和稳定性进行研究;同时将注射器装灭菌水作为水痘疫苗的稀释剂,观察水痘疫苗的质量及稳定性.结果 3批注射器装灭菌水在相对湿度(60±10)％的条件下分别于(40±2)℃放置6个月和(25±5)℃放置42个月,各项检测结果均符合药典二部“灭菌注射用水”标准.3批以注射器装灭菌水作为稀释剂的水痘疫苗的加速和长期稳定性试验结果均符合“水痘减毒活疫苗注册标准”的要求,疫苗的病毒滴度≥3.3 lg噬班形成单位/0.5 ml,牛血清白蛋白残留量＜50 ng/ml,抗生素残留量＜50 ng/剂.结论 注射器装灭菌水可作为水痘疫苗的稀释剂.     

细胞工厂培养箱在水痘疫苗生产中的应用研究

目的 应用细胞工厂培养箱在水痘疫苗生产过程中进行细胞培养和病毒培养,以提高病毒滴度,减少批间差异.方法 采用细胞工厂培养箱对MRC-5细胞和水痘病毒Oka株进行培养,以传统孵房培养为对照,比较两种方式的细胞生长和病毒感染情况,以及原液病毒滴度和半成品得率.采用t检验对结果进行比较.结果 在同批次同量细胞复苏的情况下,细胞工厂培养箱培养的细胞和病毒与传统孵房培养相比,分布更密集、更均匀,且批间差异较小.细胞工厂培养箱培养得到的水痘病毒滴度为5.1～5.2 lg噬斑形成单位(plaque-forming unit,PFU)/ml,高于传统孵房培养病毒(4.9～5.1 lgPFU/ml)(t=-3.17,P＜0.05);前者培养制备的半成品得率也高于后者,分别为100％和76％～100％(t=-2.69,P＜0.05).结论 在水痘疫苗生产过程中应用细胞工厂培养箱,能够提高病毒滴度和批间均一性,适合水痘疫苗的大规模生产.     

水痘减毒活疫苗无明胶稳定剂的筛选和应用

 目的   研制不含明胶的新型稳定剂,以提高水痘减毒活疫苗的安全性。方法   以现行水痘减毒活疫苗稳定剂配方为基础,去除明胶,配制4种不同的新型稳定剂（B、C、D、E配方）。用无明胶稳定剂制备水痘减毒活疫苗,并将制备的无明胶稳定剂疫苗（B、C、D、E疫苗）与现行的含明胶稳定剂疫苗（作为对照的A疫苗）进行比较,确定最佳稳定剂配方。结果   疫苗成品于37 ℃放置7 d后,A、B、C、D、E疫苗的相关质量指标均符合《水痘减毒活疫苗注册标准》的要求,病毒滴度分别为3.6、3.5、3.3、3.3、3.3 lg PFU/0.5 ml,但C、D、E疫苗的病毒滴度已降至临界值。疫苗成品于2~8 ℃放置24个月后,A、B、C、D、E疫苗的病毒滴度分别为3.4、3.4、3.2、3.0、2.8 lg PFU/0.5 ml,其中C、D、E疫苗的病毒滴度已低于规定的标准（3.3 lg PFU/0.5 ml）,仅B疫苗的相关质量标准符合规定的要求,且与A疫苗（对照）没有差异。 结论   去除明胶的B配方稳定剂对水痘病毒有较好的保护作用。     

麻疹风疹联合减毒活疫苗的稳定性观察

目的  观察麻疹风疹联合减毒活疫苗（麻风二联）的稳定性。方法  将17批北京生物制品研究所有限责任公司（北京公司）2012—2017年生产的麻风二联存放于（5±3）℃,分别在0、9、12、18和24个月按照企业注册标准和中国药典2010或2015年版三部要求进行相关检测。同时对新、旧车间生产的各3批疫苗进行主要质量指标比对。结果  随着存放时间延长,疫苗的病毒滴度呈逐渐下降趋势,麻疹病毒滴度波动于3.9~4.8 lg半数细胞培养感染量（CCID₅₀)/ml,风疹病毒滴度波动于4.0~4.8 lgCCID₅₀/ml,热稳定病毒滴度下降均不超过1.0 lg,疫苗水分不高于3.0%,疫苗的其余各项指标均符合企业注册标准和中国药典要求。新、旧车间生产的疫苗质量没有差别。结论  北京公司生产的麻风二联的质量稳定。