Krüppel样因子4过表达对热应激所致C2C12细胞凋亡的影响

目的 探讨Krüppel样因子4对热应激所致C2C12小鼠肌原细胞凋亡的影响.方法 采用热应激(42.5℃)处理Krüppel样因子4过表达的C2C12细胞1 h,37℃恢复12 h;采用流式细胞术、Hoechst33258染色检测细胞凋亡;采用Western blot检测凋亡相关蛋白bcl-2、bax的表达.结果 流式细胞术结果发现,两组细胞凋亡百分率较热应激前均升高,但与转空载体组相比较Krüppel样因子4过表达组升高更明显,凋亡百分率达19.6%;荧光染色可见细胞出现核固缩、凋亡小体等凋亡形态学改变;Krüppel样因子4组细胞经Western blot能检测到bcl-2、bax蛋白明显改变.结论 Krüppel样因子4可以诱导热应激所致C2C12小鼠肌原细胞凋亡.     

αB-晶状体蛋白与凋亡相关蛋白相互作用抑制C2C12细胞凋亡

目的 探讨aB-晶状体蛋白抗心肌细胞凋亡的分子机制。方法构建带6个串联组氨酸的aB-晶状体蛋白表达质粒(pcDNA3.1一aBC)，经测序证实后，转染C2C12肌原细胞株，筛选稳定高表达aB-晶状体蛋白的细胞株。采用H2O2(0.5mmol/L)诱导细胞凋亡，检测线粒体细胞色素C释放率和细胞膜磷脂酰丝氨酸细胞色素荧光     

热休克反应对内毒素所致小鼠巨噬细胞炎症因子表达的抑制作用与MAPK信号转导通路的关系研究

【目的】探讨热休克反应(HSR)对内毒素(LPS)所致MAPK信号通路的影响。【方法】采用400ng／ml LPS处理小鼠巨噬细胞(RAW264．7),通过免疫印迹,抗磷酸化抗体检测ERK、JNK、p38的磷酸化。热休克反应是将巨噬细胞在42℃的条件下培养1h,随后在37C,5％CO2条件下恢复12h。【结果】ERK、JNK、p38在LPS处理15min后即被活化,30min达高峰并持续至45min,90min后开始恢复。RT—PCR检测发现TNF—α、IL-15 mRNA水平增高。细胞经HSR(42℃ 1h,并恢复12h)后,再经LPS刺激则TNF—α、IL-15 mRNA转录受抑制,但HSR对JNK、p38、ERK等三种MAPK的活化(磷酸化)无影响。【结论】HSR抑制LPS所致的炎症因子表达不涉及MAPK信号通路。     

大鼠心肌缺血预适应延迟相的差异蛋白质的分离及鉴定

目的采用蛋白质组学技术探讨缺血预适应心肌内源性保护的分子机制。方法应用双向凝胶电泳技术分离假手术组和心肌缺血预适应延迟相组大鼠的心肌总蛋白质。结果在假手术组的双向凝胶电泳图谱上展示704±27个蛋白质点,而在心肌缺血预适应延迟相组展示778±35个蛋白质点。经凝胶图像分析找到的差异蛋白质23个,基质辅助激光解析—电离飞行时间质谱对差异蛋白进行鉴定,共鉴定出12个蛋白质。这些蛋白质包括应激反应蛋白、代谢相关蛋白、信号调节蛋白、结构蛋白等。结论这些差异蛋白可能通过其分子伴侣功能、清除自由基、改善能量代谢等发挥心肌缺血预适应延迟相的心肌保护作用。     

大鼠心肌缺血预适应相关基因5的克隆与特性分析

目的采用生物信息学分析表达序列标签AW918640以获得其所代表基因的全长序列,并对该基因进行初步的特性分析。方法利用基因银行(GeneBank)数据库,通过BLAST比对等生物信息学方法进行电子克隆,采用逆转录聚合酶链反应和基因测序等技术进行鉴定,采用mapviewer软件进行染色体定位,ExPASy和SMART软件对获得的全长基因进行翻译和蛋白质功能结构分析。结果AW918640(基因银行登录号)为一个在大鼠心肌缺血预适应后3h表达升高的表达序列标签序列,通过电子克隆得到其所代表基因的全长,且为一新基因,经逆转录取合酶链反应和基因测序证实后,将其命名为心肌缺血预适应相关基因5(MIP5),并在基因银行数据库上登录,登录号为AY553870。心肌缺血预适应相关基因5最大开放读码框为909bp,编码302个氨基酸,含有6个kelch重复基序。结论心肌缺血预适应相关基因5为一与大鼠心肌缺血预适应相关的新基因。     

采用反义寡核苷酸探讨HSP70对活性氧所致心肌细胞损伤的影响

目的探讨HSP70对活性氧所致心肌细胞急性损伤的保护作用.方法用热休克预处理诱导新生大鼠心肌细胞中HSP70的表达,采用HSP70反义寡核苷酸阻断HSP70的表达,乳酸脱氢酶释放率和细胞总蛋白质合成能力来反映H2O2 0.5 mM所致心肌细胞损伤程度.结果H2O2引起心肌细胞乳酸脱氢酶释放率明显升高,而细胞总蛋白质的合成降低.热休克预处理导致心肌细胞中HSP70表达明显增加,并使H2O:所致心肌细胞LDH释放率显著降低,细胞总蛋白质的合成基本恢复正常水平.HSP70反义寡核苷酸很大程度上阻断了HSP70的表达及热休克预处理的心肌细胞保护作用.结论在热休克预处理减轻过氧化氢所致乳鼠心肌细胞急性损伤的作用中,HSP70发挥了最主要的作用.     

热休克预处理对脂多糖所致RAW 264.7细胞迁移的影响

目的 观察热休克预处理对脂多糖所致巨噬细胞迁移的影响.方法 采用ELISA观察脂多糖预处理对RAW264.7巨噬细胞中肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β释放的影响;采用趋化实验观察脂多糖处理对RAW264.7巨噬细胞迁移的影响;采用趋化实验观察热休克预处理对RAW264.7巨噬细胞迁移的影响.结果 用500μg/L脂多糖作用RAW264.7巨噬细胞1 h,肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β的释放较对照组明显增加(P<0.05);用500μg/L脂多糖处理细胞24 h, RAW264.7巨噬细胞的迁移较对照组明显增加(P<0.05);给予细胞42.5℃热休克预处理1 h后,再予500μg/L脂多糖处理细胞,RAW264.7巨噬细胞迁移较单纯脂多糖处理组明显减少(P<0.05).结论 热休克预处理能抑制脂多糖所致RAW264.7巨噬细胞迁移.     

HSF1基因敲除小鼠胚胎成纤维细胞的永生化

目的：建立HSF1^-/-，HSF1^＋/＋两种基因型小鼠胚胎成纤维永生化细胞系，为HSF1的功能研究提供实验模型。方法：用脂质体介导的基因转染法将pSV3neo质粒导入HSF1^-/-，HSF1^＋/＋两种基因型小鼠胚胎成纤维细胞，经G418筛选，抗性克隆扩大培养，建立永生化细胞系；用PCR检测两种细胞株中目的基因的整合，用RT—PCR法鉴定SV40T基因在转染细胞中的表达；用Western blot检测所建细胞株的诱导型热休克蛋白70的表达情况。结果：有3个细胞克隆已扩大培养稳定传代达6个月，经鉴定SV40T抗原已整合到两种细胞中且稳定表达，HSF1^-/-胚胎成纤维细胞热休克蛋白70的诱导表达消失。结论：成功建立永生化HSF1^-/-，HSF1^＋/＋两种基因型小鼠胚胎成纤维细胞。     

HSF1抑制热应激所致RAW264.7巨噬细胞凋亡

目的:探讨热休克因子1(heat shock factor 1,HSF1)对热应激所致Raw2 6 4.7巨噬细胞凋亡的影响。方法:采用热应激(4 2.5℃±0.5℃)处理稳定表达小鼠HSF1基因的Raw2 6 4.7巨噬细胞1h,3 7℃分别恢复6,9,1 2,2 4 h,采用流式细胞术,hoechst3 3 2 5 8染色和DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡。结果:流式细胞术结果显示,热应激后对照组(转空载体)细胞凋亡核百分率较热应激前明显升高,9 h达峰值(约为6 0%),此时荧光染色可见3 0%的细胞出现核固缩,凋亡小体等典型的凋亡形态学改变;并于热应激后6,9,1 2 h均能检测到清晰的DNA梯状条带。与转空载体对照组相比,HSF1过表达能显著降低热应激所致凋亡及明显抑制DNA的断裂。结论:HSF1可以抑制热应激所致的Raw2 6 4.7巨噬细胞凋亡。     

NF-κB/I-κB在过氧化氢所致心肌细胞损伤中的作用机制

【目的】探讨氧化应激损伤心肌细胞的分子机制。【方法】采用 0 .5mmol/L过氧化氢 (hydrogenperoxide ,H2 O2 )作用于原代培养的新生大鼠心肌细胞 ;采用胎盘蓝染色检测细胞死亡率 ,乳酸脱氢酶 (LDH)测定试剂盒检测其释放率 ,末端标记检测细胞凋亡 ,Westernblot检测NF κB内源性抑制蛋白I κB (inhibitorκB ,I κB)含量 ,免疫组化检测NF κB在细胞内的分布情况。【结果】①H2 O2 损伤 3h ,心肌细胞死亡率和LDH释放率均较对照组明显升高 (P <0 .0 1) ;②H2 O2 损伤 2 4h ,出现大量心肌细胞凋亡 ;③I κB在H2 O2 损伤 5min即减少 ,15min时减至最低 ,而后逐渐恢复 ;④H2 O2 损伤 0 .5h可引起心肌细胞中NF κB从胞浆向胞核移位 ,2h后复位 ;⑤与单纯损伤组比 ,NF κB抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐 (pyrrolidinedithiocarbamate,PDTC)能明显降低心肌细胞LDH释放率 (P <0 .0 1)。【结论】在H2 O2 所致心肌细胞损伤中 ,既有坏死 ,又有凋亡的发生 ,而NF κB/I κB信号通路的激活可能介导了H2 O2 所致的心肌细胞损伤。