寻找一种诊治心肌损伤的新方法：鼠抗人cTnI单抗Fab段基因克隆和序列分析

背景：为将鼠抗人cTnI单克隆抗体应用人体进行体内诊断或作为治疗心肌损伤的药物载体，必须降低鼠源性抗体的免疫源性，克服其人抗鼠抗体反应，需要对其进行人源化改造。目的：克隆鼠抗人cTnI单克隆抗体Fab段基因并进行序列分析。设计：单一样本研究。单位：一所医科大学附属医院的心血管病研究所。材料：本实验于2003—01／2004—05在南京医科大学第一附属医院心血管病研究所完成。分泌鼠抗人cTnI单克隆抗体的杂交瘤细胞株(JS200202)由南京医科大学第一附属医院心血管病研究所提供。方法：设计扩增鼠IgG重链Fd段及K轻链引物，从分泌cTnI单抗的杂交瘤细胞中提取总RNA，RT-PCR扩增，对扩增产物进行分子克隆、测序及序列分析。主要观察指标：重链Fd段和K轻链基因序列及其所属亚型。结果：重链和轻链引物分别扩增出一约700bp和800bpDNA片段。经序列分析，与已发表的鼠IgG基因序列对比，其核苷酸及其所推导的氨基酸序列符合鼠IgG1 Fab段特征：在GenBank登录，登录号为AY484430(重链)，AY484431(轻链)；氨基酸序列登录号为AAR83243(重链)，AAR83244(轻链)。结论：本实验室获得了完整的鼠源性抗人cTnI单克隆抗体Fab段基因，为鼠抗人cTnI单克隆抗体的人源化改造奠定了基础。     

应用聚合酶链反应技术构建人血小板反应素1基因第13外显子编码钙结合域突变体

目的:利用聚合酶链反应定点突变技术构建人血小板反应素1基因第13外显子编码钙结合域突变体。方法:实验于2005-03/06在南京医科大学第一附属医院心血管病研究所完成。选择南京医科大学第一附属医院体检中心健康体检者血标本提取人基因组DNA,设计、合成两对引物,将突变位点设计在引物内,突变位点包含限制性内切酶BseNI酶切位点,采用聚合酶链式反应定点突变技术,应用高保真TaqDNA聚合酶,通过三轮聚合酶链扩增反应对血小板反应素1基因的第13外显子进行扩增,将第13外显子碱基8831A置换为G,对最终扩增产物进行酶切鉴定和测序。结果:获得人血小板反应素1第13外显子编码钙结合域突变体,经酶切鉴定和测序分析,除引入突变点产生预期A8831→G突变外,其余碱基序列无改变。结论:采用聚合酶链反应体外定点突变技术,成功构建人血小板反应素1基因第13外显子编码钙结合域突变体,为研究血小板反应素1基因该位点突变导致血小板反应素1蛋白的结构、功能变化奠定了基础。     

C-反应蛋白对体外培养乳鼠心肌细胞的影响

目的：应用C-反应蛋白干预体外培养的乳鼠心肌细胞，观察C-反应蛋白对心肌细胞的影响。 方法：实验于2005-05／10在南京医科大学第一附属医院心内科暨心血管病研究所完成。取新生1-3d的SD乳鼠，无菌操作取出心脏，去除大血管和心房后将心脏剪碎，加入适量0．125％胰蛋白酶反复消化至完全。所得消化液中加入含血清的DMEM培养基，离心后弃上清，沉淀用含0．1％Brdu、体积分数为0．15新生牛血清的DMEM培养基混悬。细胞密度稀释至6&;#215;10^8L^-1，接种至六孔板中，放入37℃，体积分数为0．05的CO2孵育箱内培养。24h后换液除去Brdu，取第3天细胞进行研究。采用充氮气孵育4h模拟缺氧造成心肌细胞损伤（缺氧组），以未缺氧组做对照，缺氧组与未缺氧组均加用不同浓度的C-反应蛋白（0，10，55，100mg／L）进行干预，测定细胞培养上清心肌肌钙蛋白Ⅰ的含量及脂质过氧化产物丙二醛与超氧化物歧化酶的含量以观察C-反应蛋白对心肌细胞的影响。并通过免疫组织化学观察C-反应蛋白在细胞的分布情况。 结果：①细胞形态及搏动率的改变：未缺氧组细胞搏动率总体随C-反应蛋白浓度的增加而增加，但在缺氧4h组，细胞搏动率在C-反应蛋白55mg／L时达到最高峰[（132&;#177;9）次／min，P〈0．051。②培养细胞上清肌钙蛋白Ⅰ含量的变化：在未缺氧组和缺氧4h组，肌钙蛋白Ⅰ均随C-反应蛋白浓度的增加而增高，且C-反应蛋白浓度为100mg／L时的增幅最高[C-反应蛋白为0，10，55，100mg／L时的肌钙蛋白Ⅰ浓度：缺氧组分别为（0．789&;#177;0．066），（1．198&;#177;0．101），（1．979&;#177;0．151），（3．714&;#177;0．288）μg／L；未缺氧组分别为（0.332&;#177;0．034），（0．377&;#177;0．054），（0．527&;#177;0．057），（0．867&;#177;0．077）μg／L，P〈0．051。③细胞上清超氧化物歧化酶、丙二醛含量变化：各组丙二醛含量的变化趋势与肌钙蛋白Ⅰ相似，随C-反应蛋白浓度的增加而增加，而超氧化物歧化酶活力则随C-反应蛋白浓度的增加而降低。④免疫组织化学结果显示：随着C-反应蛋白浓度的增高，细胞着色变深，细胞密度变低，体积变小。相同C-反应蛋白浓度下，损伤组细胞的变化比未缺氧组更明显。 结论：C-反应蛋白对心肌细胞具有显著的损伤作用，尤其在已有缺氧损伤的基础上。     

卫氏并殖吸虫成虫重组抗原的表达与鉴定

目的 表达已转化入大肠杆菌的卫氏并殖吸虫成虫抗原(PwAg)基因，并评价其应用于免疫学诊断的价值。方法 用IPTG诱导表达已亚克隆人表达载体pRESETB的卫氏并殖吸虫成虫抗原基因，以SDS—PAGE和Westernblot分析鉴定表达产物。结果 SDS-PAGE电泳可见32ku处有1条明显的蛋白质带，该带只被卫氏并殖吸虫成虫免疫兔、感染犬和病人血清识别。结论 成功构建重组克隆PwAg，其表达产物具有卫氏并殖吸虫成虫期特异性，推测可用于并殖吸虫病的免疫学诊断。     

社区居民对社区护理服务的满意度调查及其影响因素分析

目的：探讨社区居民对社区护理服务的满意度及其影响因素。方法：采用匿名问卷调查,以自评的方式先在我院下属社康中心随机抽取4个,再在这4个社康中心服务范围内随机调查居民各200名,共调查居民800名。调查内容包括人口学特征、居民对社区护理的了解及满意度等。并对社区护理满意率与可能影响因素以及影响因素对社区护理工作满意度分别进行相关分析和解释性分析。结果：居民对社区护理满意率为58.56%,影响社区护理服务满意度的主要因素有居民对社区护士的熟悉程度、居民个人或家庭健康档案建立情况、社区护理人员家庭访视情况等。结论：了解社区居民对护理工作的满意率,对于提高社区护理质量,加强社区护理管理有着积极的作用。     

膝关节功能锻炼操对膝骨关节炎患者的社区应用及康复护理

目的探讨膝关节功能锻炼操对膝骨关节炎功能恢复的社区康复护理效果。方法将48例膝骨关节炎患者随机分为观察组和对照组。在药物治疗、理疗的基础上,观察组采用自行设计的膝关节功能锻炼操行关节功能恢复训练,锻炼3周后,以Lequesne膝骨关节炎严重程度指数评分表对两组患者膝关节功能状态进行评估。结果观察组Lequesne评分改善明显优于对照组。结论膝关节功能锻炼操对膝骨关节炎患者膝关节功能恢复有显著促进作用,方法简便、安全、易行、无风险,可在社区居家康复中推广。     

卫氏并殖吸虫基因片段的亚克隆及其表达的研究

目的：获得诊断肺吸虫病的特异性重组抗原，以了解其作为免疫诊断抗原的价值。方法：将免疫筛选获得的卫氏并殖吸虫基因克隆双酶切，所得cDNA片段亚克隆入表达载体pRESETB，经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达，以聚丙烯凝胶电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹法（Western blotting)对表达产物进行鉴定。结果：成功地将文库中2个大小不同的卫氏并殖吸虫基因片段连接到载体中，其中Pw-2重组子特异性表达产物是分子质量约为32ku的蛋白带，可被卫氏并殖吸虫免疫免血清特异性识别。结论：成功构建了编码卫氏并殖吸虫特异性抗原的重组克隆Pw-2。     

弓形虫病基因诊断的动物实验研究

目的：建立敏感、特异、稳定的PCR法，用于弓形虫病诊断。方法：选择与合成引物并确立最佳扩增条件，用PCR法检测实验感染鼠血液中弓形虫DNA，并与ELISA法检测循环抗原(CAg)作比较。结果：该PCR检测弓形虫DNA法特异性强，对其他7种寄生虫DNA均不扩增；敏感性高，可检测到0．2pg DNA；检测急性感染弓形虫小鼠血液最早于感染后第2天出现用性，与ELISA法查CAg比较。PCK检测弓形虫DNA法阳性出现时间早、检出率高。结论：该PCR法可应用于弓形虫感染的早期诊断。     

机关老年人阻塞性睡眠呼吸暂停与代谢综合征关系初探

目的调查和分析>60岁机关打鼾人群中阻塞性睡眼呼吸暂停综合征(OSAS)与代谢综合征(MS)的关系。方法 采用整群抽样法,2008年10月至2009年4月,在我院体检中心接受健康体检的>60岁的机关打鼾者共156例纳入研究。现场完成抽样问卷调查,并完成夜间7h多导睡眠仪(PSG)监测,按呼吸暂停低通气指数(AHI)将156例分为Ⅰ组(AHI≤5)、Ⅱ组(AHI>5)。全部进行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)并测定空腹葡萄糖、空腹胰岛素、餐后2h血糖、总胆固醇(TC)、三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇和尿酸。计算HOMA指数、体质量指数(BMI)。结果 该组打鼾者ESS评分0～20分,中位分值为5分。156例中Ⅰ组119例,占总数76.3%;Ⅱ组37例,占总数23.7%。经比较2组间各指标和疾病状态,具有显著性差异的是:腰围、BMI、相关症状得分、TC、LDL-C、血糖水平和HOMA指数、MS和脑血管病(P均<0.05)。结论 >60岁机关打鼾人群中OSAS患者,具有更多的MS的危险因素和显著的胰岛素抵抗,脑血管疾病患病率更高,临床症状更为严重。需要社会高度重视对>60岁打鼾人群的OSAS筛查和防治,同时对OSAS高危人群主张早期干预。     

沙美特罗氟替卡松联合噻托溴铵与低剂量强的松联合氨茶碱对COPD肺心病患者心功能的影响

目的 :比较吸入沙美特罗氟替卡松联合噻托溴铵与口服低剂量强的松联合氨茶碱对慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)合并肺心病患者心功能的影响。方法:选取稳定期COPD合并肺心病患者111例随机分为3组,每组37例,常规治疗(利尿剂、血管扩张剂、强心剂)相同。对照组:未使用任何支气管扩张剂及激素类药物;吸入剂组:沙美特罗氟替卡松粉雾剂(50/500μg)1吸,2次/d、噻托溴铵1吸,1次/d,吸入;口服药组:强的松5 mg,1次/d,缓释型氨茶碱100 mg,2次/d,口服。分别于治疗前、治疗48周后测定患者的右心室流出道内径、右心室内径、右肺动脉干内径、平均肺动脉压、射血分数(LVEF)、钠尿肽(BNP)并比较分析,同时分析患者的空腹血糖、血浆皮质醇、骨密度。结果:与治疗前相比,治疗后吸入剂组、口服药组患者的心功能指标均有改善(P<0.05),且较对照组均有改善(P<0.05);吸入剂组在改善患者的右心室流出道内径、右心室内径、右肺动脉干内径、射血分数、钠尿肽方面稍优于口服药组(P<0.05),在改善平均肺动脉压方面差异无统计学意义(P>0.05)。治疗前后,3组患者空腹血糖、血浆皮质醇及骨密度对比均无显著性差异(P>0.05),且3组患者治疗前后血浆皮质醇水平均在正常值范围内。结论:在稳定期COPD合并肺心病的治疗中,吸入沙美特罗氟替卡松联合噻托溴铵与口服低剂量强的松联合氨茶碱均可改善患者心功能,其中吸入剂效果更佳。