流式细胞仪分选侧群细胞条件的探索与优化

目的探讨不同浓度的荧光染料(Hoechst 33342)和抑制剂维拉帕米(verapamil)对流式细胞仪分选侧群(SP)细胞的影响。方法实验分为Hoechst 33342组(Hoechst 33342浓度分别为2.5、5.0和7.5μg/mL)和抑制组(Hoechst 33342+verapamil,verapamil浓度分别为50、100和150μmol/L),用流式细胞仪分选人肺腺癌细胞系A549中SP细胞,摸索Hoechst 33342和verapamil的最佳浓度,并用本实验室构建的一株肿瘤细胞系K1进行验证。结果在verapamil和Hoechst 33342浓度分别为150μmol/L和7.5μg/mL时,A549细胞染色充分,SP细胞亚群与非SP(non-SP)细胞亚群分群明显,SP细胞约为2.2%。K1细胞在verapamil为50μmol/L和Hoechst 33342为5μg/mL时,SP细胞亚群与non-SP细胞亚群分群明显,SP细胞亚群可被verapamil抑制,其比例约为1.3%。分选后的SP细胞和non-SP细胞可进一步扩增培养。结论 Hoechst 33342和verapamil可影响肿瘤细胞中SP细胞分选效率。     

腐食酪螨转录组测序及生物信息学分析

目的　获得腐食酪螨转录组数据,为后续基因功能研究奠定基础。方法　基于Illumina HiSeqTM 2000高通量测序平台,对腐食酪螨雌雄混合螨体进行测序,采用Trinity软件组装转录本获得单基因簇（Unigenes）。将单基因簇与非冗余蛋白质序列（RefSeq non?redundant protein sequence,NR）数据库、核苷酸序列（nucleotide sequence database,NT）数据库、Swiss?Prot数据库、京都基因和基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）数据库、直系同源簇（clusters of orthologous groups,COG）数据库中的蛋白质序列进行比对,对其进行功能注释。将单基因簇按照NR、Swiss?Prot 蛋白库优先级顺序进行编码序列（coding sequence,CDS）比对、预测。利用MISA软件对腐食酪螨Unigenes进行简单重复序列（simple sequence repeats,SSR）位点分析。使用SOAPsnp技术检测螨虫单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）。结果　转录组测序数据质控后获得4.67 Gb高质量数据,组装后获得51 271个单基因簇,总长度为41 848 995 个核苷酸（nucleotide,nt）、平均长度为816 nt。将单基因簇与公共数据库进行比对和功能注释后,得到29 053个有功能注释的Unigenes。预测发现27 443条CDS,检测到23 092个SSR位点信息和148 027个SNP位点信息。结论　通过测序技术建立了腐食酪螨转录组数据库,获得了大量腐食酪螨转录本信息,为后续过敏相关基因功能学研究奠定了基础。     

MicroRNAs与肾相关疾病诊断的研究进展

肾脏代偿功能强大,肾相关疾病早期症状不明显,易延误治疗契机导致肾脏不可逆性病变,严重影响人类生存和生活质量。微小RNAs(microRNAs,miRNAs)在机体的生长发育中必不可少,研究表明,miRNAs在疾病的发生、发展以及预后中发挥着重要作用。本文就近年来miRNAs在肾相关疾病早期诊断和预后评价中的研究进展作一综述。     

人脐带间质干细胞来源的exosomes对肝细胞过氧化损伤的保护作用

摘要：目的: 探讨人脐带间质干细胞来源的exosomes（hucMSC-Ex）对四氯化碳(CCL4)诱导的肝细胞氧化应激损伤的保护作用。 方法：将体外培养的人肝细胞系HL7702分为对照组（常规培养）、CCL4损伤组及hucMSC-Ex处理组（CCL4+hucMSC-Ex）。免疫荧光检测CM-Dil染料标记的hucMSC-Ex进入HL7702细胞的情况;免疫组织化学法分析细胞过氧化物8-羟基脱氧鸟嘌呤（8-OHdG）的表达水平;比色法检测培养上清中谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）的含量;western blot分析P38MAPK通路的活化情况。 结果：免疫荧光结果显示,hucMSC-Ex可转移进入HL7702细胞;比色法结果表明,与对照组相比,CCL4损伤组HL7702细胞培养上清中GSH含量下降,MDA上升（P<0.01）,hucMSC-Ex处理组GSH和MDA含量无显著性变化;免疫组化结果显示,与对照组相比,CCL4损伤组8-OHdG表达阳性的HL7702细胞（胞核棕黄色）数量明显增高,而hucMSC-Ex处理组阳性细胞数量无明显变化;western blot结果表明,CCL4损伤组P-P38蛋白表达水平明显上升,而hucMSC-Ex处理组P-P38蛋白表达下降,其P-P38与P38/GAPDH蛋白的灰度值较CCL4损伤组下降约2.4倍。 结论：HucMSC-Ex可减轻CCL4诱导的肝细胞过氧化损伤。     

脐带间质干细胞来源的外切体对顺铂诱导的人肾小管上皮细胞损伤的修复作用

［摘要］目的: 研究人脐带间质干细胞来源的外切体（hucMSC-Ex）对顺铂诱导的人肾小管上皮HK-2细胞损伤的修复作用,并探讨可能的作用机制。方法: 体外建立顺铂诱导的HK-2细胞损伤模型,实验组以16 μmol/L浓度的顺铂作用HK-2细胞16 h,再加入hucMSC-Ex共培养,同时选择人肺成纤维细胞的外切体（HFL1 Ex）为对照,8 h后采用蛋白质印迹法和FITC-Tunel技术检测hucMSC-Ex对损伤HK-2细胞的抗凋亡和促增殖情况。未经任何处理的HK-2细胞作为正常对照组,单纯顺铂损伤并加等量PBS为PBS对照组。结果： 成功建立了顺铂诱导的HK-2细胞损伤体外模型, 蛋白质印迹分析显示hucMSC-Ex处理改善了顺铂对HK 2细胞的损伤,凋亡蛋白Bax表达降低,抗凋亡蛋白Bcl-2表达相应升高。FITC-Tunel检测也显示HK-2细胞的凋亡明显减弱。而MTT分析显示hucMSC Ex处理后,HK 2细胞的增殖能力显著增强。结论：HucMSC-Ex对顺铂诱导的HK-2细胞损伤有一定的修复效果,可能是通过促进HK 2细胞的增殖和抑制其凋亡来实现的。     

大鼠骨髓间质干细胞来源的外切体抑制顺铂诱导的肾小管上皮细胞凋亡

目的:观察大鼠骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)来源的外切体(exosome)对顺铂诱导的肾小管上皮细胞凋亡的影响。方法:原代培养大鼠骨髓MSC并提取外切体鉴定。构建顺铂损伤NRK-52E细胞模型,损伤组为5μmol/L顺铂处理6 h后正常营养液培养48 h,处理组为顺铂损伤后以100μg/m L外切体共培养48 h。未经任何处理的NRK-52E细胞为对照组。TUNEL-FITC,凋亡双染流式细胞术,蛋白质免疫印迹技术检测各组细胞凋亡情况。结果:与对照组比较,损伤组NRK-52E细胞肿大,胞核不规则样改变,凋亡细胞增多,凋亡相关蛋白Bax上调而Bcl-2下调;处理组NRK-52E细胞肿大较损伤组缓解,胞核形态改善,凋亡细胞减少,Bax下调且Bcl-2上调。结论:大鼠骨髓MSC来源的外切体对顺铂诱导的NRK-52E细胞凋亡有一定的抑制作用。     

人脐带间充质干细胞来源的exosomes对脂多糖诱导的肝星状细胞活化的抑制研究

目的探讨人脐带间充质干细胞(hucMSC)来源的外体(exosomes,hucMSC-Ex)对脂多糖(LPS)诱导的人肝星状细胞系LX2活化的抑制作用及其可能机制。方法体外培养LX2细胞,分别设PBS对照组、LPS组(100 ng/mL)及hucMSC-Ex组(LPS+150μg/mL hucMSC-Ex),48 h后收集细胞并提取相应的RNA及蛋白质。western blot检测LX2活化相关指标(α-SMA、ColΙα1及TGF-β1蛋白)和凋亡指标(Bcl2、Bax及caspase3蛋白)的表达情况;RT-PCR和荧光定量RT-PCR检测α-SMA mRNA表达水平;MTT法分析hucMSC-Ex对LX2细胞活化后增殖的影响。结果 LPS可刺激LX2细胞活化,活化后的LX2细胞形态由不规则形状向成纤维细胞样改变,并高表达α-SMA、ColΙα1及TGF-β1蛋白,其灰度值分别上升约2.45、2.34、2.77倍(P均0.05);Bax及caspase3蛋白表达下降而Bcl2蛋白表达增强;LX2增殖能力增强;经hucMSC-Ex处理后,细胞形态由细长向不规则形态转变,α-SMA、ColΙα1及TGF-β1蛋白表达减弱,高表达Bax及caspase3蛋白而Bcl2蛋白表达下降,且细胞增殖减少(F=23.44,P0.05)。结论 hucMSC-Ex能够抑制LPS诱导的LX2细胞活化,降低其增殖能力并促进细胞凋亡。