细胞治疗对脊髓前角运动神经元保护作用的实验研究

目的研究注射不同的异体细胞于大鼠失神经靶肌肉对脊髓前角运动神经元的保护作用。方法雌性6周龄SD大鼠36只,体重120～150g;随机分为四组,每组9只。无菌条件下切断左侧坐骨神经,一期神经外膜缝合。术后即于小腿三头肌处注射相应细胞,7d注射1次,共4次。A组注射1×106/ml单纯雪旺细胞1ml、B组注射1×106/ml雪旺细胞加成肌细胞1ml（雪旺细胞∶成肌细胞为1∶1）、C组注射1×106/ml混合细胞提取液1ml（雪旺细胞∶成肌细胞∶肾内皮细胞为1∶1∶1）、D组无血清培养液1ml作对照。术后3个月进行脊髓前角运动神经元内C-Jun表达及酶组织化学观察。结果术后3个月,A、B及C组的C-Jun阳性表达脊髓前角运动神经元的形态均较D组好,神经元数目明显多于D组。各组脊髓前角运动神经元内C-Jun活性表达：A组128.591±0.766,B组116.729±0.778,C组100.071±2.017,D组144.648±2.083;D组与A、B及C组比较,差异有统计学意义（P〈0.01）;A、B组间及B、C组间比较,差异均有统计学意义（P〈0.01）。脊髓前角运动神经元内酶组织化学观察：A、B及C组神经元胞体轮廓清楚,胞体饱满,D组神经元胞体轮廓模糊,胞浆和细胞核界限不清晰。各组脊髓前角运动神经元酶活性比较,差异均有统计学意义（P〈0.01）。结论雪旺细胞、雪旺细胞加成肌细胞、混合细胞提取液均有保护脊髓前角运动神经元的作用,混合细胞提取液优于雪旺细胞及雪旺细胞加成肌细胞。     

hBMSCs诱导分化类髓核细胞

目的 探讨人椎间盘细胞和关节软骨细胞的分子表型差异,分析hBMSCs经TGF-β,和BMP-7联合诱导后能否分化为软骨细胞和髓核细胞.方法 取9例自愿捐赠者髂嵴骨髓20～40 mL分离培养hBMSCs.取第4代hBMSCs行三维微球培养.根据基础培养基中加入的生长因子不同,实验分成4组,分别为加入10 ng/mL TGF-β3组(A组)、200 ng/mL BMP-7组(B组)、同时加入两种生长因子组(C组)以及空白对照组(D组).于培养后21 d,行组织学及免疫组织化学观察:于培养后4、21 d进行PCR检测Ⅰ、Ⅱ、Ⅹ型胶原、蛋白多糖和SOX9基因的表达.结果 培养后21 d,HE染色示A组和C组细胞呈软骨细胞样形态特征,甲苯胺蓝染色及免疫组织化学染色Ⅱ型胶原表达呈阳性.B组和D组细胞形态无明显改变,PCR检测示培养后21 d,A、C组SOX9、蛋白多糖、Ⅰ型胶原及Ⅱ型胶原表达较4 d时明显增加(P＜0.05).B、D组Ⅰ型胶原表达较4d时明显增加(P＜0.05),SOX9、蛋白多糖及Ⅱ犁胶原较4d时无明显变化(P＞0.05).其中仅A组X型胶原表达呈阳性.结论 TGF-β,和BMP-7联合应用能促进hBMSCs分化更接近于椎间盘细胞,可能为椎间盘组织工程提供种子细胞.     

组织工程肌腱保存过程中细胞存活率研究方法初步探讨

目的探讨组织工程肌腱保存过程中细胞存活率研究的方法. 方法采用碘化丙啶(PI)将第4代人成纤维细胞的死细胞染色,双苯并咪唑染料(Ho)染色活细胞后经适当波长紫外光激发,分别产生红色荧光和蓝色荧光,利用流式细胞仪区分活细胞和死亡细胞;将组织工程化肌腱种子细胞悬液4 ml(6.0×105个/ml)平分成两管,其中一管反复冻融,将细胞冻死;另一管不冻.再将两管细胞按不同比例混合,采用荧光染色流式细胞仪分析,研究其量效关系;并用荧光摄影,图像分析,即刻及2小时荧光标记到流式细胞仪,检测对细胞存活率的影响. 结果荧光染色流式细胞分析可反映加入冻融死细胞比例与存活细胞的量效关系,即细胞存活率与未冻融细胞和冻融细胞比例分别成正、负相关,相关系数r=0.970(P＜0.05);荧光摄影后图像分析也显示了同样的量效关系,r=0.982(P<0.05);荧光标记后2小时检测比即刻检测细胞存活率降低,但差异无统计学意义(P>0.05);通过荧光显微镜可直接观察组织工程化肌腱上的细胞. 结论 PI和Ho荧光染色后流式细胞仪分析及荧光摄影是组织工程肌腱保存过程中细胞存活率研究的较好方法.     

不同保存方法对生物衍生骨支架材料细胞相容性的影响

目的了解不同保存方法对生物衍生骨支架材料细胞相容性的影响.方法冻干生物衍生骨用两种不同保存液同等条件4℃冷藏保存3个月,以保存相同时间冻干生物衍生骨为对照.实验分为A组:成骨细胞复合 1号保存液处理材料培养;B组:成骨细胞复合 2号保存液处理材料培养;C组:成骨细胞复合冻干骨培养;D组:单纯成骨细胞培养.以2×106个/ml密度的成骨细胞悬液复合材料培养1、3、5和7天.用倒置相差显微镜和扫描电镜观察细胞的黏附和生长情况、检测细胞活力、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性及流式细胞仪分析细胞周期.结果成骨细胞与三种不同方法保存的材料均可黏附,并在材料孔隙内生长、分化和增殖.复合培养1和3天,各组间无显著差异;复合培养5和7天,黏附于材料的细胞活力大小依次为 A组>C组>B组 (P＜0.01,P＜0.05).复合培养7天,黏附于材料的细胞ALP活性大小依次为 A组>C组>B组(P＜0.01) .各组细胞周期未见明显变化,未见异倍体细胞.结论选择适宜的保存液对生物衍生骨支架材料的细胞相容性有一定优化作用.     

改良的硬组织包埋技术对乳牙破骨细胞的观察

硬组织切片技术主要应用于骨组织、羟基磷灰石等坚硬标本的切片制作。牙齿比以上标本更坚硬。传统的牙齿标本是将一颗牙齿磨成一张薄片来观察其结构 ,且不能进行一般组织样本的染色观察。为了解儿童乳牙髓腔内破骨细胞的数量 ,进而为收集破骨细胞进行培养提供依据 ,我们采用硬组织两次包埋技术 ,使切片可进行组织学、免疫组织化学染色 ,获得较理想的破骨细胞观察结果 ,报告如下。1　材料与方法　　莱卡 16 0 0切割机 ,莱卡 2 5 0 0 E切片机 ,口腔慢速涡轮机 ;乙二醇乙醚乙酸酯 ,甲基丙烯酸甲酯 ,过氧化苯甲酰 ,离体乳牙。第 1渗透液 :甲基…     

剖宫产术时出血121例临床分析

剖宫产术在一定程度上降低了孕、产妇及国产儿死亡率，但手术死亡率及并发症均明显高于阴道分娩者(1)。为探讨剖宫产术时出血的防治措施，现对我院1994～1996年剖宫产术时出血121例作回顾性分析如下。1临床资料1．1研究对象：本组初产妇108例，经产妇13例。产妇年龄22～38岁，平均年龄26．7岁。孕周34”’～41＋’周，平均孕周39．7周。1·2诊断标准和测量方法：以剖宫产术时出血＞500ml为诊断标准。测量方法是以剖宫产时吸净羊水后用负压瓶计量及纱布血染估计测量的综合测量法。l．3结果：（1）本组出血量最少为500ml，最多为3700ml，平均…     

组织工程化骨修复猕猴长段骨缺损的实验研究

目的 探讨用生物衍生骨材料和骨髓基质干细胞(MSCs)复合后构成的组织工程化骨对异体猕猴长段骨缺损的修复作用。方法 于猕猴胫骨结节抽取MSCs并使诱导分化为成骨样细胞，用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记，培养后与人源生物衍生骨材料体外复合构成组织工程化骨，植入15只异体猕猴修复桡骨2．5cm长段骨缺损作为实验组；用单纯生物衍生骨材料修复对侧同样骨缺损作为对照组；另取2只猕猴双侧桡骨同样部位和大小骨缺损旷置作为空白组。术后1、2、3、6和12周时各处死3只动物取材，空白组12周取材，行大体观察、组织学和免疫组织化学检测。结果 实验组和对照组术后1、2和3周移植物周围组织反应较明显，6周后明显减轻，12周时基本消失。实验组标记成骨样细胞于术后6周仍存在，术后12周基本消失；骨缺损部位骨样组织、软骨、编织骨和板层骨出现时间均较对照组早，且骨愈合时间提前3～6周。实验组骨缺损以多点方式直接成骨，对照组则从两端以“爬行替代”方式成骨。空白组术后12周骨缺损均无愈合。结论 生物衍生骨材料和MSCs复合构建的组织工程化骨异体植入修复猕猴长段骨缺损可超越骨段移植的“爬行替代”过程，使骨缺损能较快愈合。生物衍生骨材料和同种异体MSCs复合组织工程化骨可作为构建骨组织工程的一种较好选择方式。     

左旋精氨酸对大鼠成骨细胞的影响

一氧化氮（NO）是一种可高度弥散的自由基。作为第2信使和神经递质，是细胞-细胞间信息传递的重要调节因子。NO可以调节成骨细胞（osteoblast，OB）的增殖及其功能活性，从而在维持骨形态和骨重建中起着重要作用。我们在以往实验基础上，观察不同浓度的NO外源性供体左旋精氨酸（L—arginine）对大鼠OB增殖，护骨素（OPG）分泌及cNOS和iNOS表达的影响。[第一段]     

膀胱平滑肌细胞与小肠黏膜下层体外复合培养的实验研究

目的探讨体外快速培养犬膀胱平滑肌细胞的方法及观察膀胱平滑肌细胞在脱细胞小肠黏膜下层(small intestinal submucosa,SIS上的生长状况,为构建组织工程膀胱平滑肌组织提供实验依据。方法分别采用酶消化法和组织块培养法分离、获取和原代培养犬膀胱平滑肌细胞,倒置相差显微镜下观察细胞的生长情况,透射电镜观察细胞的超微结构,免疫组织化学染色进行细胞鉴定。将犬膀胱平滑肌细胞接种到SIS支架材料上,于复合培养5、7及9d取材,行苏木素染色、石蜡切片HE染色和扫描电镜观察膀胱平滑肌细胞在SIS上的生长状况。以细胞-SIS复合培养组为实验组,以膀胱平滑肌细胞为对照组,每组各设9孔,分别于接种后3、5及7d取材,酶消化后收集细胞并计数。结果酶消化法原代培养获取犬膀胱平滑肌细胞数量多,细胞生长速度快,形态良好,培养5d细胞在培养瓶底生长汇合。组织块培养法接种3d见长梭形的膀胱平滑肌细胞从植块边缘萌出,获取的细胞数量较少。透射电镜下见膀胱平滑肌细胞胞质中有特征性细肌丝和细胞膜的密斑。抗α-肌动蛋白免疫组织化学染色胞浆呈棕黄色阳性反应。膀胱平滑肌细胞在SIS表面能黏附、生长和增殖。体外复合培养5d后,膀胱平滑肌细胞铺满SIS表面,呈单层细胞结构。7、9d细胞形态与5d相似。实验组3、5及7d的细胞计数分别为(16.85±0.79)×105、(39.74±2.16)×105及(37.15±2.02)×105个,对照组分别为(19.43±0.54)×105、(34.50±1.85)×105及(33.07±1.31)×105个。两组5d细胞计数差异有统计学意义(P<0.05)。结论酶消化法原代培养膀胱平滑肌细胞可提供大量活性良好的种子细胞。SIS支持膀胱平滑肌细胞黏附和生长,可为构建组织工程膀胱平滑肌组织提供良好支架。