ELISA法检测曲霉半乳甘露聚糖的影响因素

商品化GMELISA法（Platelia Aspergillus）是一种酶免夹心法,用鼠单克隆抗体EB．A2检测半乳甘露聚糖（galactomannan,GM）,GM是菌丝在组织生长过程中从细胞壁释出的热稳定杂多糖,有一个非免疫原性甘露聚糖核心和含半乳呋喃糖基的免疫反应性侧链。该实验是识别GM分子的β1—5一D一半乳呋喃糖侧链,它的检测限约为1ng／ml,4h内可得到结果,     

精子蛋白17异常表达与卵巢癌细胞对铂类药物耐药的相关性研究

目的:观察精子蛋白17(Sp17)的异常表达对体外培养的卵巢癌细胞顺铂和卡铂耐药性的影响.方法:将Sp17基因转染卵巢癌细胞系HO8910,采用流式细胞术测定目的蛋白的表达,获得稳定高表达Sp17的卵巢癌细胞系HO8910/Sp17.MTT法检测铂类药物对转染细胞HO8910/Sp17的生长抑制作用并与未转染的亲代细胞进行比较.结果:在有效剂量范围内,顺铂和卡铂对HO8910/Sp17细胞的抑制率明显低于亲本细胞HO8910,P<0.05.耐药指教顺铂1.4,卡铂1.38.结论:Sp17明显增加卵巢癌细胞对铂类化疗药物的耐药性.     

抗精子蛋白17单克隆抗体对人卵巢癌细胞SKOV-3的抑制作用

目的观察抗精子蛋白17单克隆抗体(anti-Sperm protein 17 monoclonal antibody,anti-Sp17 mAb)对卵巢癌细胞系SKOV-3的体外抗肿瘤活性和机制。方法采用MTT法观察抗anti-Sp17 mAb对肿瘤细胞SKOV-3的细胞毒作用;以外周血单个核细胞PBMCs为效应细胞,SKOV-3为靶细胞,在效靶比分别为80∶1、40∶1和20∶1的条件下,观察anti-Sp17 mAb的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用;以SKOV-3为靶细胞,加入浓度为2.5%、5%、10%和20%的健康人新鲜血清作为补体,观察单抗的补体依赖性细胞毒性。结果anti-Sp17 mAb对SKOV-3无明显细胞毒作用;与对照组相比,单抗对SKOV-3的ADCC作用呈剂量依赖关系,在效靶比为80∶1,孵育24 h后,细胞生长抑制率约为22%;补体的加入也可显著提高单抗对SKOV-3细胞生长的抑制率,在血清浓度为5%,单抗浓度为10 μg/ml时抑制率达到了40%。结论anti-Sp17 mAb对表达Sp17蛋白的卵巢癌细胞株SKOV-3具有明显的ADCC和CDC效应。     

血清精子蛋白17检测的双抗夹心ELISA法及在卵巢癌诊断中的应用

目的:建立双抗夹心ELISA法检测血清中精子蛋白17(sperm protein 17, Sp17)水平.方法:以重组Sp17蛋白为免疫原制备兔抗Sp17抗体,建立Sp17双抗夹心ELISA检测方法,鉴定其最小检出限、精确度、回收率,并检测42例正常人及28例卵巢癌患者血清Sp17水平.结果:该双抗夹心ELISA法敏感度高、特异性强、重复性好.卵巢癌患者与正常人血清Sp17含量有显著差别(P＜0.01),正常人血清中存在少量Sp17蛋白,而卵巢癌患者血清中Sp17含量明显升高者占39.3%.结论:卵巢癌患者血清中Sp17含量明显升高.测定血清Sp17水平的ELISA方法学确立为阐明Sp17在卵巢癌患者中的免疫生物学意义提供了实验手段.     

结核分枝杆菌γ-干扰素体外释放定量试验对结核病诊断价值的回顾性分析

摘要：目的：回顾性分析结核分枝杆菌γ-干扰素体外释放定量试验(TB-IGRA)对结核病的诊断价值。 方法：收集2013年10月至2014年9月进行TB-IGRA检测的住院患者367例,其中结核病患者89例,包括69例肺结核患者和20例肺外结核病患者,非结核疾病患者278例作为对照,分析TB-IGRA法诊断结核病的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值,并与痰涂片镜检法、结核抗体胶体金法、结核抗体蛋白芯片法进行比较。 结果：TB-IGRA在肺结核和肺外结核患者中检出的阳性率分别为86.9%和95.0%,差异无统计学意义(P>0.05),且两组间IFN-γ释放水平也无统计学意义（P>0.05)。而结核病组的IFN-γ水平明显高于非结核疾病组（P<0.01）,且治疗有效时IFN-γ水平显著降低甚至转阴。TB-IGRA法的诊断敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值分别为88.8%、76.6%、54.8%和95.5%。痰涂片镜检、胶体金法检测结核抗体和蛋白质芯片法检测结核抗体的敏感性分别为32.5%、13.7%和38.5%。TB IGRA与另3种方法敏感性差异有统计学意义(P<0.01)。 结论：TB-IGRA对结核病具有良好的敏感性和阴性预测值,是一种有价值的结核病辅助诊断方法,但特异性和阳性预测值较低,阳性结果还需结合临床加以判断。动态监测IFN-γ水平可以提示抗结核治疗疗效。     

巢式PCR检测血清中烟曲霉基因的实验研究

目的评价巢式PCR在烟曲霉侵袭性感染早期病原学诊断中的应用价值。方法构建烟曲霉播散性感染动物模型,收集不同感染时段动物血液标本20份,分别进行巢式PCR检测和真菌培养,并对感染动物多次进行影像学检查;测定25例临床诊断为侵袭性曲霉病患者的45份血清样本,并与血清半乳甘露聚糖（GM）测定结果进行比较。结果巢式PCR检测疾病模型动物血清曲霉特异基因,标本阳性率为80%（16/20）,最早在感染后的第二天即可检出;而在整个感染过程中,血培养结果均为阴性,影像学检查则在感染后期才提示真菌感染的存在。临床标本的检测结果显示,巢式PCR敏感性和特异度分别为64%和100%。结论巢式PCR具有较好的敏感性及特异度,可用于曲霉深部感染的早期诊断,与血清GM测定联合应用诊断意义更大。     

抗烟曲霉硫氧还蛋白还原酶GliT抗体对侵袭性曲霉病的诊断价值

摘要：目的：建立检测抗烟曲霉硫氧还蛋白还原酶GliT（TRG）抗体的ELISA法,评价其对侵袭性曲霉病（IA）的诊断价值。 方法：选择非中性粒细胞缺乏症IA患者42例、中性粒细胞缺乏症IA患者34例、血培养为其他真菌或细菌的非IA患者155例及体检健康者200例作为研究对象。用重组TRG作为包被抗原建立检测血清抗TRG抗体的ELISA法,检测研究对象血清抗TRG抗体水平,并与半乳甘露聚糖（GM）试验比较。建立兔IA模型观察抗TRG抗体产生的情况。 结果：ELISA法检测抗TRG抗体的cut off值为0.514。非中性粒细胞缺乏症 IA患者抗TRG抗体A值为0.827（0.571,1.234）,抗TRG抗体阳性率为81.0%（34/42）;中性粒细胞缺乏症 IA患者抗TRG抗体A值为0.445（0.250,0.924）,阳性率为41.2%（14/34）。非中性粒细胞缺乏症 IA患者、中性粒细胞缺乏症 IA患者组血清抗TRG抗体水平高于健康人＋非IA患者对照组［0.191（0.134,0.293）,U分别为2 669.5、855,P均<0.01。对于非中性粒细胞缺乏症 IA患者,抗TRG抗体ELISA检测法的敏感性高于GM试验（81.0% vs 52.3%,χ²=6.72,P<0.01）;对于中性粒细胞缺乏症 IA患者,GM试验的敏感性高于抗TRG抗体ELISA检测法（85.3% vs 41.2%,χ²=6.72,P<0.01）。2者联合检测,可使诊断非中性粒细胞缺乏症和中性粒细胞缺乏症IA的敏感性分别提高至88.1%（37/42）和91.2%（31/34）。血清抗TRG抗体在IA初期阶段持续升高,抗真菌治疗有效后,抗TRG抗体水平逐渐降至正常。兔IA模型显示感染烟曲霉1周后即出现抗TRG抗体,且抗体滴度快速增高。 结论：抗TRG抗体是辅助诊断非中性粒细胞缺乏症IA患者的潜在的标志物。     

检测3种侵袭性真菌感染相关抗体的蛋白质芯片法

摘要：目的：用念珠菌烯醇化酶（Eno）、果糖二磷酸醛缩酶（Fba1）及烟曲霉硫氧还蛋白还原酶（TR）3种基因重组蛋白质,建立检测这3种蛋白质特异性抗体的蛋白质芯片法,并进行临床应用评价。 方法：用重组Eno、Fba1和TR作为固相抗原构建蛋白质芯片。对芯片制备及血清中相应抗体测定的反应条件进行优化。对方法的重复性、稳定性及特异性进行考察,并测定临床确诊的侵袭性念珠菌病（IC）、侵袭性曲霉病（IA）患者血清中的相应抗体。 结果：蛋白质芯片以硝酸纤维素膜为固相载体,以Tris-HCl为载样液,重组Eno、Fba1、TR最适点阵浓度分别为0.5 mg/mL、0.04 mg/mL和1.0 mg/mL,用含50 g/L脱脂奶粉的PBS溶液封闭,待测血清稀释度为1∶10。抗Eno抗体和抗Fba1抗体诊断IC的敏感性和特异性分别为67.6%（71/105）和96.5%（299/310）,64.8%（68/105）和90.3%（280/310）;联合检测抗Eno抗体和抗Fba1抗体,可将敏感性提高至81.0%。抗TR抗体诊断IA的敏感性为71.4%（30/42）,特异性为98.1%（366/373）。 结论：建立了同时检测两种真菌的3种不同抗体的蛋白质芯片方法,敏感性尚可,可用于高危人群的筛查。     

重组烟曲霉二肽基肽酶Ⅴ片段的原核表达

摘要：目的：筛选抗原性强的烟曲霉二肽基肽酶Ⅴ（dipeptidyl peptidases Ⅴ,DPPⅤ）肽段并进行原核细胞表达。 方法：通过生物信息学分析技术,从DPPⅤ全长序列中选取抗原决定簇密集的片段,采用生物合成和PCR技术,获得其肽段相应的DNA序列,并克隆至测序载体;DNA测序验证后构建重组表达质粒,转染原核表达宿主菌BL21(DE3), IPTG诱导表达后用Talon亲和层析柱纯化;western blot分析产物免疫反应性。 结果：DPPⅤ19~144p及DPPⅤ145~447p在大肠埃希菌中均以包涵体形式表达, DPPⅤ19~447p以可溶性蛋白质形式表达。western blot结果表明筛选出的DPPⅤ肽段均可与侵袭性曲霉病（IA）患者血清发生抗原抗体反应。 结论：成功表达烟曲霉二肽基肽酶不同抗原决定簇分布的3个肽段,且重组片段均具有良好免疫反应性。     

CIK体外抗癌活性分子机制的探讨

目的:分析细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer cell, CIK)抗肿瘤活性增强的分子机制.方法:从健康人志愿者和恶性肿瘤患者PBMC培养获得CIK细胞,用LDH释放法分别对PBMC和CIK进行体外杀伤肿瘤细胞的活性测定,用流式细胞术分析PBMC和CIK细胞群中颗粒溶素(granulysin, GNLY)和穿孔素(perforin, PFN)的表达.结果:在效靶比为5∶1时,健康人和肿瘤患者PBMC对肿瘤细胞K562的裂解率分别为6.33%和1.29%,两组CIK细胞对肿瘤细胞K562的裂解率分别为14.7%和14.16%,PBMC与CIK对细胞的裂解率显著提高,P<0.01;GNLY阳性表达细胞百分比由4.43%和1.95%上升到19.15 % 和17.52%,P<0.01.但PFN细胞却由21.91 % 和14.69%降低到4.96%和3.7%,P<0.05.结论:肿瘤患者PBMC抗肿瘤活性下降可能与该细胞中GNLY和PFN表达减少有关;CIK细胞杀伤肿瘤活性的提高可能与GNLY的表达增加相关;PFN表达下降可能是维持CIK细胞在体外大量增殖的调节因素.