登革病毒IgG抗体的检测:基于登革病毒E蛋白的荧光素酶免疫吸附法

目的 建立基于登革病毒E蛋白特异性抗原的荧光素酶免疫吸附法（DENV-LISA）,用于检测DENV IgG抗体。方法 分别构建DENV1-E1、DENV2-E2与荧光素酶的融合表达质粒,转染293T细胞后获得含特异性抗原与荧光素酶的融合蛋白,建立DENV-LISA,评价其特异度和灵敏度,并与商用登革病毒IgG抗体检测试剂盒比较。结果 DENV-LISA阳性检出率32.4%,特异度96.6%,商用检测试剂盒阳性检出率35.3%,差异无统计学意义（P>0.05）;阳性样本稀释6400倍可判断阳性,灵敏度高;同批板间、板内检测值差异无统计学意义（P>0.05）;重复性良好。结论 建立基于登革病毒E蛋白的荧光素酶免疫吸附法,对登革病毒IgG抗体有较高特异度和灵敏度,可用于登革病毒感染的早期筛查、监测预警、流行病学调查等。     

在体光学分子影像技术在乳腺癌基础及临床研究中的应用

在体光学分子影像作为一种快速发展的生物医学影像技术,以其实时、定量及非侵入性等特点,已被广泛应用于各学科的研究中.光学分子影像技术在监测乳腺癌的远处转移、检测肿瘤细胞的凋亡、细胞周期、细胞乏氧与肿瘤血管生成、观察ER介导的分子路径、观察乳腺癌干细胞等基础研究领域及在乳腺癌早期诊断、引导前哨淋巴结活组织检查、药物疗效评价、检测乳腺癌原癌基因人类表皮生长因子受体2 (HER-2)表达等基础研究及临床应用中有着良好的前景.     

HSPA1A启动子荧光素酶报告基因HepG2细胞体系在评价焦炉逸散物毒性中的应用

目的 探讨利用含HSPA1A(HSP70-1)启动子荧光素酶报告基因质粒的稳定转染HepG2/HSPA1A细胞评价焦炉逸散物毒性的可行性.方法 构建含HSPA1A启动子的pGL4.17/HSPA1A重组质粒并转染人HepG2细胞,建立稳定细胞株HepG2/HSPA1A.用不同浓度的炉底、炉侧和炉顶焦炉逸散物染毒HepG2/HSPA 1A细胞24h,分别测定细胞的相对荧光素酶活力、存活率、丙二醛(MDA)含量、Olive尾距和微核率.结果 与对照组相比,炉底焦炉逸散物染毒组细胞的相对荧光素酶活力明显升高,差异有统计学意义(P＜0.01).且在0.15 μg/L时,细胞的相对荧光素酶活力最高,为对照组的1.4倍.细胞的相对荧光素酶活力分别随着炉侧和炉顶焦炉逸散物浓度的增加而逐渐增加,差异均有统计学意义(P＜0.01).且在最高浓度时(65.4 μg/L,202 μg/L)细胞的相对荧光素酶活力分别为对照组的2.1和5.3倍.仅炉底焦炉逸散物染毒后细胞的相对荧光素酶活力与MDA浓度呈正相关,差异有统计学意义(r=0.404,P＜0.05).炉底、炉侧和炉顶焦炉逸散物染毒后,HepG2/HSPA1A细胞的相对荧光素酶活力均与Olive尾距、微核率呈正相关(r尾距分别为0.476、0.940、0.788,r微核率分别为0.580、0.649、0.432),P＜0.05.结论 HepG2/HSPA1A细胞的相对荧光素酶活力可以敏感地反映焦炉逸散物的毒性效应,该细胞可用于快速评估职业环境复合污染物的综合毒性效应.     

miR-570对胃癌细胞B7-H1蛋白表达的抑制作用

B7-H1是一种重要的负性共刺激分子,在肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用,而微小RNA具有直接的转录后调控作用。本文研究miR-570对B7-H1表达的调控作用。首先将miR-570及其抑制剂anti-miR-570分别转染B7-H1表达阳性的人胃癌细胞SGC-7901和B7-H1表达阴性的人乳腺癌细胞MDA-MB-435,以流式细胞术检测B7-H1分子表达情况;然后构建pcDNA/B7-H1表达质粒与miR-570共转染CHO细胞,以流式细胞术检测CHO细胞上B7-H1分子的表达情况;最后分别构建含B7-H1基因3-UTR片段和含miR-570作用靶点序列的荧光素酶表达载体与miR-570共转染CHO细胞,用双荧光素酶报告系统检测荧光素酶活性。结果显示miR-570能显著抑制SGC-7901细胞和B7-H1基因转染细胞膜上B7-H1蛋白的表达,并能显著抑制荧光素酶表达载体表达的荧光素酶蛋白,而且anti-miR-570能上调MDA-MB-435细胞上B7-H1表达。本研究证明miR-570能显著抑制B7-H1蛋白表达,为通过抑制B7-H1信号通路以增强机体抗肿瘤免疫力的治疗途径奠定了基础。     

鼻咽癌细胞中ezrin基因启动子上游序列转录调控特性的研究

目的:研究鼻咽癌细胞中ezrin基因启动子上游序列的转录调控特性。方法:构建一系列携带ezrin基因-1541/-706序列的报告基因表达载体,ezrin基因-1541/-706序列以正向和反向分别连接至不含启动子的报告基因上游、ezrin启动子上游、SV40启动子上游、ezrin启动子或SV40启动子控制的报告基因下游,将质粒转染CNE2细胞,检测荧光素酶活性。结果:CNE2细胞中,当-1541/-706序列正向位于报告基因上游时表现出启动子活性,其转录激活作用约为ezrin启动子的50%;反向连接时无启动子活性。而且,当-1541/-706序列正向位于ezrin启动子或SV40启动子上游时,显著提高荧光素酶表达;当反向位于启动子下游、正向或反向位于启动子控制的报告基因下游时,转录增强作用消失。结论:CNE2细胞中ezrin基因启动子上游序列具有转录激活和转录增强作用,这种作用具有DNA序列位置和方向依赖性。     

腺病毒介导荧光素酶报告基因感染间充质干细胞的研究

目的 构建携带萤火虫荧光素酶(Luc)报告基因的腺病毒载体(Ad-Luc),研究其感染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)后的体内外生物发光成像.方法 从psiCHECK-2质粒中用PCR扩增Luc基因,克隆入腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV后行Nhe Ⅰ/Xba Ⅰ双酶切和测序鉴定.重组腺病毒穿梭载体与骨架载体pAdeno同源重组并包装纯化后,测定其病毒滴度.用重组Ad-Luc感染BMSC,行体外生物发光成像确定最佳感染复数(MOI),并采用曲线拟合回归分析生物发光强度与MOI的关系.以锥虫蓝染色法评价细胞活力变化,计算细胞存活率.将转染后BMSC(1×106个)植入SD大鼠前肢肌肉内,行体内生物发光成像.细胞存活率组间比较采用两因素重复测量资料方差分析.结果 经酶切和测序鉴定证明,Ad-Luc构建成功,病毒滴度为1×1010空斑形成单位(PFU)/ml.体外生物发光检测结果显示最佳MOI值为50,Ad-Luc可高效感染BMSC,使其表达Luc,且拟合曲线示细胞生物发光强度随MOI增加而增强(R2 =0.98).转染组和未转染组细胞培养1、3、5、7d时,细胞存活率分别为(92.5±2.3)％与(94.1±1.8)％、(91.4±0.9)％与(92.7±2.0)％、(92.1±1.6)％与(93.3±2.4)％、(91.9±1.5)％与(93.0±3.1)％,2组间细胞活力的差异无统计学意义(F=4.38,P＞0.05).体内生物发光成像结果示BMSC移植1、3、7d后仍有存活,但随时间延长,生物发光信号逐渐减弱.结论 Luc报告基因通过腺病毒载体成功转入BMSC,实现了光学报告基因成像对移植干细胞的示踪.     

口腔鳞癌细胞中ITGB6基因主要转录调控区域的定位分析

目的： 鉴定ITGB6基因在口腔鳞癌细胞中的主要调控区域,为研究ITGB6基因在口腔鳞癌细胞中的转录调控机制奠定基础。方法：构建含有ITGB6基因转录起始点上游5' 端侧翼区不同长度DNA序列的重组pGL2荧光素酶报告基因质粒,转染口腔鳞癌细胞株TCA8113和SAS,利用双荧光素酶报告基因系统检测启动子转录活性,并通过生物信息学方法预测ITGB6基因中潜在的主要转录因子结合位点。结果：获得一系列不同长度ITGB6基因5' 侧翼区序列的重组荧光素酶报告基因质粒;当ITGB6基因5' 端侧翼片段截短到-187～-35和-35～+27之间时,启动子活性均显著下降;生物信息学分析显示,在-187～-35区域有2个Ets-1的潜在结合位点,而在-35～+27区域有1个IRF-4潜在结合位点。结论：在口腔鳞癌细胞中,ITGB6基因-187~-35和-35~+27区域是主要的转录因子结合区。     

人脂联素基因启动子荧光素酶报告基因载体的构建

目的:克隆不同长度人脂联素基因(AD)启动子片段,构建含人AD启动子片段的荧光素酶报告基因载体并进行测序鉴定。方法:利用PCR技术从人全血基因组DNA中扩增出AD启动子片段,经纯化酶切后克隆入载体pGL-3 basic中,形成重组质粒,筛选阳性克隆进行测序,并与GenBank比对。结果:从人全血基因组DNA中PCR扩增得到1.1 kb和2.1 kb AD启动子片段,构建2种报告基因载体,将其命名为AD promoter1.1-pGL-3 basic和AD promoter2.1-pGL-3 basic,经测序证实所插入的目的片段与GenBank检索的人AD启动子序列99.6%匹配。结论:成功构建了含人AD启动子片段的报告基因载体。     

Gene therapy targeted to telomerase in HCC by AF-hTERT-TK/GCV

Objective： The aim of this study was to observe the affection of targeted therapy to plasmid AF-pGL3-hTERT-TK in HCC cell line HepG2. Methods： We constructed therapeutic plasmid pGL3-hTERT-TK （containing suicide gene TK that promoted by promoter of hTERT） and was conjugated with AF-liposome （a protein that can combine with the receptor ASPGR on HCC cell surface）. Then we transfected HCC cell line HepG2 and hepatic cell L02 with AF-pGL3-hTERT-TK, observed the effects of therapeutic plasmid AF-pGL3-hTERT-TK for HCC cell line growth and apoptosis in vitro by Flow cytometry and Tun- nel method. Results： Our results showed that TK gene was 1100 bp in plasmid pGL3-hTERT-TK. Plasmid pGL3-hTERT-TK can effectively transfect HCC cell HepG2 and the transfection rate was 8.91%. By recognizing and combining effects of recep- tor protein ASPGR on HCC cell surface the therapeutic plasmid AF-pGL3-hTERT-TK could easily enter into HCC cell HepG2 and induce its apeptosis. The apoptosis rate was 85.87% while only 8.65% in L02 cell. Four days after AF-pGL3-hTERT-TK transfected HepG2 was intervention by ganciclovir （GCV）, a lot of apeptotic bodies were found by Tunnel analysis, while little apoptotic body was found in hepatic cell L02. Conclusion： AF-pGL3-hTERT-TK can target to HCC cell line and induce it to apoptesis, almost has no influence on hepatic cell L02. AF-pGL3-hTERT-TK has the potential therapeutic effects for HCC.     

重组人甲胎蛋白基因顺式调控元件功能的研究

将６种含有人甲胎蛋白（ＡＦＰ）基因启动子、增强了和／或沉寂子不同组合的荧光素酶报告基因真核表达载体分别转染３种人肝癌细胞系及１种肺腺癌细胞系，测定瞬时表达的荧光素酶活性。结果显示６种重组人ＡＦＰ基因顺式作用元件在ＡＦＰ阳性肝癌细胞均具有特异启动活性，而在ＡＦＰ阴性的肝癌细胞和非肝癌细胞无启动活性。在这６种重组人ＡＦＰ顺式元件中，以２．２ｋｂ的调控元件（去除了ＡＦＰ基因沉寂子。保留其启动子和增强子序列）启动活性最高，从而为下一步的靶向性肝癌基因治疗提供了较理想的肝癌细胞特异性启动元件。