性传播疾病

几种性传播疾病病原体检测芯片的制备——石岗等(北京军事医学科学院放射医学研究所100850)；《军事医学科学院院刊》，2004，28(5)：405-409[目的：为了同时多样本检测和鉴别淋病奈瑟球菌、沙眼衣原体和解脲脲支原体3种重要的性传播疾病病原体，制备了寡核苷酸检测芯片。方法：针对3种病原体和荧光素酶基因设计特异的引物和寡核苷酸探针，采用硫代和氨基双功能探针修饰技术制备寡核苷酸芯片，     

CACNB2基因多态性与原发性高血压的关联性研究

目的 探讨钙离子通道β2亚基基因(calcium channel β2 gene,CACNB2)多态性与温州汉族人群原发性高血压的相关性及应用荧光素酶报告基因技术检测rs7069292不同等位基因对基因表达的影响.方法 收集原发性高血压患者637例,以血压正常者600名作对照,采用飞行时间质谱分型技术对CACNB2基因rs2228645、rs2357928、rs7069292、rs7099380、rs10764319和rs11014166共6个SNP位点进行分型.构建CACNB2基因5’上游-2831 bp到-2460 bp的rs7069292的侧翼序列的荧光素酶报告基因载体.结果 高血压组rs7069292 CT基因型频率及C等位基因频率高于正常对照组(5.20％ vs.2.17％,2.59％ vs.1.08％,均P＜0.05),分型未发现rs7069292 CC基因型;含rs7069292 C等位基因的启动子活性与T等位基因相比明显增高,差异有统计学意义(P＜0.05);其余5个SNP位点各基因型频率及等位基因频率与对照组比较差异均无统计学意义(均P＞0.05).结论 CA CNB2基因rs7069292多态性与温州汉族人群原发性高血压病有关联,T＞C变异可能是CACNB2基因功能表达的一个影响因子.     

肝原位移植瘤裸鼠模型的建立及活体荧光成像检测

目的 建立能够通过活体荧光成像系统实时监测肿瘤进展的肝原位移植瘤裸鼠模型.方法 重组质粒pcDNA3.1-Luc转染细胞构建稳定表达荧光素酶的PLC/PRF/5肝癌细胞株,将该细胞注入裸鼠肝脏实质内,应用活体成像技术动态监测肿瘤进展情况,解剖荧光信号阳性裸鼠观察肿瘤组织生长情况.免疫荧光检测肿瘤组织中HBsAg表达.结果 对裸鼠肝原位移植瘤应用活体荧光系统成像,在肿瘤细胞注射部位检测到荧光信号,解剖动物后可在肝脏组织中观察到异质细胞团块.免疫荧光证实移植瘤中有HBsAg表达.结论 肝脏原位移植瘤裸鼠模型建立成功,为抗肝癌药物的研发提供了工具.     

稳定表达hTERT/Luc的小鼠黑色毒瘤肺转移模型的建立

目的 建立稳定共表达荧光素酶基因和人端粒酶逆转录酶(hTERT)的小鼠黑色素瘤B16细胞系,并通过尾静脉注射的方式建立小鼠肿瘤肺转移模型.方法 利用DNA重组技术将hTERT基因和荧光素酶基因Luc定向插入到真核表达载体,构建真核表达质粒pIRES-neo-hTERT和pIRES-hyg3-Luc,利用阳离子脂质体LipofectamineTM 2000共转染小鼠黑色素瘤B16细胞,经G418及潮霉素B加压筛选出稳定转染的细胞株.应用Western blot法及免疫荧光法检测hTERT和Luc基因在B16细胞中的表达;将稳定共表达hTERT和Luc的B16-hTERT/Luc细胞株通过尾静脉注射的方式接种雄性C57BL/6小鼠建立肿瘤肺转移模型,并通过活体成像技术检测小鼠肺部肿瘤的生长.结果 建立了稳定共表达hTERT和Luc的小鼠黑色素瘤B16单克隆细胞株B16-hTERT/Luc,经检测hTERT基因和荧光素酶基因Luc在单克隆细胞株中的表达分别为84％和98％.通过尾静脉注射的方式成功建立了小鼠肿瘤肺转移模型,应用活体成像技术能方便地检测到B16-hTERT/Luc肿瘤在小鼠体内的生长情况.结论 成功建立了可用于活体成像技术检测的稳定表达hTERT的小鼠黑色素瘤肺转移模型.     

带荧光素酶基因的乙型脑炎病毒SA14-14-2感染性克隆的构建及鉴定

目的：构建带有荧光素酶基因的乙型脑炎（简称乙脑）病毒感染性克隆,并通过体外拯救获得恢复病毒,用于乙脑病毒致病机理研究、病毒感染在小鼠体内的动态分布以及乙脑疫苗免疫效果评价的高通量方法建立。方法：应用反向遗传学、融合PCR以及无缝拼接等体外重组技术,将荧光素酶报告基因（F-LUC）插入到乙脑病毒SA14-14-2全长感染性克隆的5''非编码区与C蛋白编码区之间,线性化后体外转录为RNA并转染BHK21细胞,在细胞感染和动物试验分别检测恢复病毒的拯救和F-LUC的表达情况。结果：成功构建了带有F-LUC报告基因的SA14-14-2乙脑病毒全长感染性克隆,并拯救获得了重组病毒。基因序列分析及细胞与动物水平均证明拯救的病毒可较高水平表达荧光素酶基因。结论：本研究构建出带有荧光素酶报告基因F-LUC的SA14-14-2感染性克隆,并拯救获得带有荧光素酶的重组乙脑病毒,为乙脑血清中和抗体的高通量筛选、病毒感染在小鼠体内的动态分布和致病机理研究奠定了基础。     

使用人骨钙素启动子实现在体研究成骨细胞特定基因的功能

目的:使用骨钙素启动子构建骨组织特异性小发卡状RNA表达载体.方法:实验于2003-11/2004-09在解放军第四军医大学全军骨科研究所和全军整形外科中心完成.以HEK293细胞基因组为模板,利用聚合酶链反应扩增人骨钙素启动子.将骨钙素启动子、针对虫荧光素酶的小发卡状RNA编码序列和多腺苷酸信号依次克隆至pGL3-control载体的相应酶切位点,经双酶切鉴定和DNA测序证实后命名为pGL3-OCP-shLuc.将pGL3-OCP-shLuc与pGL3-control分别共转染人胚胎肾细胞HEK293和人骨肉瘤细胞MG-63,48 h后测定虫荧光素酶活性,计算相对活性.结果:使用特异性引物成功扩增出长度为830 bp的人骨钙素启动子聚合酶链反应产物.DNA测序结果证实pGL3-OCP-shLuc中的小发卡状RNA表达框与设计完全一致.pGL3-OCP-shLuc与pGL3-control共转染HEK293细胞后,虫荧光素酶相对活性与对照组相比没有明显差异,而共转染MG-63细胞后虫荧光素酶相对活性显降低,剔出效率约为69.8%.结论:成功使用人骨钙素启动子构建了小发卡状RNA表达载体,并实现了骨组织特异性RNA干扰,为将RNA干扰技术引入骨肉瘤基因治疗领域奠定了基础.     

PAI-1启动子序列与荧光素酶报告基因扩增及载体连接问题分析

目的探讨纤溶酶原激活物抑制剂-1(Plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)启动子荧光素酶表达质粒构建中扩增、转化、酶切及连接的问题。方法利用PCR技术扩增1100 bp长度PAI-1启动子片段,与PUC-19T载体连接,将PUC19T-PAI-1 1100质粒,及荧光素酶报告基因pGL3-Basic质粒转染大肠肝菌(DH5a)后扩增,提取并纯化;以BglⅡ,MluⅠ酶切,电泳并回收PAI-1 1100片段和pGL3-Basic酶切大片段,将PAI-1 1100片段插入荧光素酶报告基因pGL3-Basic中,构建含PAI-1 1100片段荧光素酶质粒。结果扩增PAI-11100 bp片段成功,目的片段与载体PUC19T,pGL3-Basic载体连接条件较苛刻,需要增加连接时间及效率的摸索。结论控制扩增时DNA浓度,胶回收,感受态质量,LB平板质量,内切酶,连接时间及质量比等问题都可增加连接成功概率。     

PrLZ基因3′-UTR区荧光素酶报告基因载体的构建及活性检测

目的分析前列腺亮氨酸拉链(PrLZ)基因3′非编码区(3′-UTR)可能的微小RNA(miRNA)调控位点,构建PrLZ基因3′-UTR荧光素酶报告载体,为研究PrLZ基因转录后的miRNA调控提供有效的工具。方法使用PCR方法从PrLZ阳性的C4-2细胞中扩增含PrLZ基因3′-UTR区序列,插入到T-Vector载体上,提高PCR产物的连接、克隆效率,通过Xbal和BamHI限制性内切酶双酶切后将其连入经相同内切酶双酶切后的荧光素酶报告基因载体pLUC中,构建pLUC-PrLZ 3′-UTR载体,使用生物信息学方法预测PrLZ基因3′-UTR可能是miR-34a的作用靶点,使用慢病毒载体构建对照载体(质粒名称-NC)和过表达miR-34a(质粒名称-miR-34a),包装成病毒颗粒后分别感染293-T细胞,然后通过X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent转染试剂将pLUC空质粒和pLUC-PrLZ 3′-UTR重组质粒分别转染293-T细胞,Promega试剂盒测定荧光素酶的活性。结果得到含PrLZ基因3′-UTR序列的荧光素酶报告重组质粒,并用凝胶电泳和基因测序的方法验证了其序列的正确性。在miR-34a高表达组的293-T细胞中,重组质粒组荧光素酶活性比空质粒组低40%,差异具有统计学意义(P0.05)。结论成功构建PrLZ基因3′-UTR荧光素酶报告载体,miR-34a可以显著降低荧光素酶的活性,PrLZ基因3′-UTR上可能有miR-34a的调控作用靶点。     

miR-449a通过靶向KLF4蛋白导致血管平滑肌细胞表型转化

目的探讨miR-449a对于血管平滑肌细胞表型转化、增殖和迁移的作用。方法首先构建携带miR-449a抑制剂、miR-449a mimic的质粒和携带KLF4 siRNA的病毒,并将其转染到血管平滑肌细胞当中,用即时荧光定量PCR检测miR-449a的量,用Western blot检测KLF4的表达量,并检测表型转化相关代表蛋白SM-MHC、α平滑肌肌动蛋白、骨桥蛋白。同时,用CCK-8和细胞划痕试验来评估细胞的增殖和迁移状况。用免疫荧光检测蛋白表达量及细胞结构变化。用荧光素酶报告基因实验来证实miR-449a与KLF4之间的关系。结果实验发现,miR-449a的下调可以增加KLF4的表达以此达到促进血管平滑肌细胞表型转化的作用,并增加其增殖和迁移能力。结论可以通过上调miR-449a降低KLF4的表达,从而抑制血管平滑肌细胞的表型转化及降低其增殖和迁移能力。