HIV-1 Tat蛋白结合Tar的抗艾滋病药物筛选模型的建立研究

目的建立HIV-1Tat蛋白结合Tar的抗HIV-1药物筛选模型用于抗HIV药物筛选。方法构建表达HIV-1Tat蛋白的真核表达质粒（pCDNA3，1（＋）-Tat）和HIV-1 LTR-luc荧光素酶报告基因，采用脂质体转染法共转染HeLa细胞，荧光仪检测Tat蛋白促进荧光素酶在HeLa细胞内的表达情况，建立HIV-1Tat蛋白结合Tar的细胞模型，用于抗HIV-1的药物筛选。以DRB（5，6-二氯-1-β-呋核亚硝脲-苯并咪唑）为阳性对照，进行模型的建立及条件的优化。结果通过反复试验表明，目的基因和报告基因的配比、转染时培养液中小牛血清的含量、细胞浓度、转染前细胞状态以及药物作用时间的长短等对模型的稳定性和敏感性有影响。结论应用优化的细胞模型对文冠果、紫苏等浸提物进行筛选及结果的分析。     

低氧对人肺腺癌A549细胞迁移和黏附的影响

目的：探讨低氧对人肺腺癌A549细胞迁移以及与血管内皮细胞黏附的影响。方法：细胞划痕实验和Transwell实验检测低氧对A549细胞迁移和浸润的影响；细胞黏附实验检测低氧对A549细胞与血管内皮细胞黏附的影响；免疫荧光法观察低氧对A549细胞中E-cadherin、β-catenin、纤维状肌动蛋白（F-actin）分布的影响；荧光素酶报告基因检测低氧对A549细胞中依赖于缺氧诱导因子-1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）的转录活性的影响。结果：低氧可以促进A549细胞的迁移、浸润和与血管内皮细胞的黏附，影响A549细胞中E-cadherin和β-catenin的分布及F-actin细胞骨架的重排，上调A549细胞中依赖于HIF-1的报告基因的表达。结论：低氧促进A549细胞的迁移、浸润和与血管内皮细胞的黏附可能是通过调控A549细胞中依赖于HIF-1基因的表达，进而影响细胞中E-cadherin和β-catenin分布和F-actin细胞骨架的重排。     

小鼠LRP5基因负调控区分析

为研究小鼠LRP5基因-1 229 bp~-1 034 bp之间存在的负调控区,在此区域内构建了3种荧光素酶报告基因表达载体,即pGL3-1229(-1 229 bp~-914 bp),pGL3-1130(-1 130 bp~-914 bp)及pGL3-1051(-1 051 bp~-914 bp)。以PRL-TK为内参照质粒,瞬时转染COS-7,48 h后收集细胞测定荧光素酶相对表达活性。结果表明pGL3-1229质粒的相对荧光素酶活性是pGL3-1130的26%,有显著性差异。在-1 229 bp~-1 130 bp之间存在负调控元件,软件分析COUP可能是小鼠LRP5基因的负调控元件,有待进一步突变分析证实。     

MDR1启动子/荧光素酶质粒的构建及其在朊蛋白高表达胃癌细胞中的活性检测

目的:构建含MDR1基因启动子的荧光素酶报告基因质粒,并检测其在朊蛋白高表达胃癌细胞系中的活性表达。方法:PCR克隆人MDRl基因启动子片段,通过亚克隆将启动子分别插入到pMD18-T载体和荧光素酶报告基因pGL3-Enhancer载体中,建立含MDR1启动子的荧光素酶报告基因质粒pGL-MDR1,并经测序及酶切确定扩增序列;脂质体基因转染法将pGL-MDR1转染入朊蛋白高表达胃癌细胞系SGC7901-PrP,并测定其荧光素酶活性。结果:PCR克隆出MDR1启动子经DNA测序证实序列正确,pGL-MDR1转染入朊蛋白高表达胃癌细胞系的荧光素酶活性,较转染入pcDNA3.1空载体细胞系相比升高3~5倍。结论:成功构建含MDRl启动子的荧光素酶报告基因质粒;上调朊蛋白表达可激活MDR1的转录活性。     

MDR1 基因单靶点双荧光素酶报告基因系统的建立

目的通过构建以MDR1启动子为启动序列的双荧光素酶报告基因系统并进行活性分析，为MDR1基因表达的单靶点调控研究和逆转剂的筛选提供一种有效的方法。方法从HCT-8细胞中提取DNA并克隆含有MDR1基因启动子中Y—box序列。将该序列重组到萤光素酶报告基因载体pGL-3．Basic的启动区域中，从而构建报告基因载体pGL-MDR1。将pGL-MDR1和pRL-TK载体共转染到HCT-8和HCT-8／VCR细胞中。通过调节不同载体的比例来优化转染效率。利用MDRI基因激活剂（热诱导）和抑制剂（EGCG）等处理来分析其启动转录活性受外界因素的影响。结果通过直接测序法验证了pGL-MDR1含有MDR1基因启动子Y—box序列且没有出现碱基突变。在pGL-MDR1和pRL-TK的转染比例为5：5时，转染效率最高并具有最高的萤光素酶活性。通过MDR1基因激活处理后表现为时间依赖性地激活MDR1基因的表达，而MDR1基因抑制剂的作用则相反。结论MDR1启动子为启动序列的双荧光素酶报告基因系统建立成功。该系统不但可以用于研究活体生物发光成像和MDRI基因表达的机理，而且可用于单靶点的多药耐药抑制剂的筛选。     

白细胞介素1β促进GH3细胞中人生长激素基因表达的机制

目的研究白细胞介素1β(IL-1β)对大鼠垂体GH3细胞中人生长激素(hGH)基因启动子活性的影响及其可能的调节机制.方法采用荧光素酶报告基因方法.建立含hGH基因启动子(-484～30 bp)和荧光素酶融合基因的稳定转染GH3细胞株,然后加入IL-1β或IL-1β与胞内信号转导途径的抑制剂,通过检测细胞培养液和细胞裂解液中GH的含量以及GH3细胞内荧光素酶的变化,反映IL-1β对GH分泌、合成、hGH基因启动子活性的影响及可能的作用机制.结果IL-1β(10～104U/ml)均能刺激大鼠垂体GH3细胞中GH的分泌和合成,102～104 U/ml的IL-1β还能剂量依赖性地增加细胞中荧光素酶的表达,最高达对照组的161%;在胞内信号转导抑制剂中,丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)特异性抑制剂PD98059(40μmol/L)和p38MAPK抑制剂SB203580(5 μmol/L)均能完全阻断IL-1β促进GH3细胞中荧光素酶表达的作用,磷脂酰肌醇3激酶(PI3-K)抑制剂LY294002(10 μmol/L)能部分抑制IL-1β的促进作用;Pit-1蛋白过表达和表达被抑制对IL-1β的促进作用没有影响;在含不同长度hGH基因启动子序列的质粒中,IL-1β促进GH3细胞中hGH基因启动子活性的关键序列在-196～-132 bp之间.结论IL-1β能增强垂体GH3细胞中hGH基因的启动子的活性,此作用可能需要激活细胞内依赖MAPK、p38MAPK和PI3-K等激酶的信号转导途径完成,并与hGH基因上游-196～-132 bp启动子序列密切相关,但与Pit-1蛋白无关.     

基于荧光素酶生物发光检测方法的研究及其应用进展

生物发光现象广泛存在于自然界中,不管是在陆地或是海洋都有发光生物的踪迹。其中基于荧光素酶的生物发光系统被广泛研究,启发着人类在基因、表观遗传等方面进行探索,并且开发出一系列相关的检测方法,用于体内体外各方面研究。本文从生物发光系统、荧光素酶的种类以及荧光素酶生物发光检测方法的开发与应用这几个方面进行总结,简要概括近年来基于荧光素酶生物发光检测的研究进展。     

维生素D_3对报告载体荧光素酶表达的作用

目的：　研究１,２５－二羟维生素Ｄ３ 对结肠癌细胞系Ｃａｃｏ－２ 细胞中报告基因表达的作用,并探讨在报告载体ｐＧＬ２ 序列中存在潜在的抑制性维生素Ｄ应答元件（ＶＤＲＥ）的可能性。方法：　采用磷酸钙沉淀法将报告载体转染入Ｃａｃｏ－２ 细胞。Ｃａｃｏ－２细胞经不同浓度１,２５－二羟维生素Ｄ３ 处理后测定细胞裂解液中表达的荧光素酶活性。结果：　应用ｐＧＬ２ 报告载体时,当用ｐＳＧ５－ＶＤＲ表达载体共转染后,１,２５－二羟维生素Ｄ３显著地抑制Ｃａｃｏ－２ 细胞荧光素酶的表达（Ｐ＜ ０．０５）;而未使用该表达载体共转染则无抑制作用（Ｐ＞ ０．０５）。应用ｐＧＬ３ 报告载体时,不同浓度的１,２５－二羟维生素Ｄ３ 对ｐＬＧ３转染后Ｃａｃｏ－２ 细胞表达的荧光素酶活性均无显著抑制作用（Ｐ＞ ０．０５）,该作用不依赖是否存在有ｐＳＧ５－ＶＤＲ表达载体共转染。结论：１,２５－二羟维生素Ｄ３ 对报告载体ＰＧＬ２ 荧光素酶表达具有抑制作用,而对ｐＧＬ３ 则否;类似人类ＰＴＨ基因中的潜在抑制性ＶＤＲＥ存在于报告载体ｐＧＬ２,在ｐＧＬ３ 中该ＶＤＲＥ业已改变。     

1,25-二羟维生素D_3抑制报导载体pGL_2荧光素酶表达的研究

通过磷酸钙沉淀法将载体DNA转染Caco－2细胞。Caeo－2细胞经不同浓度1,25一二羟维生素D3处理后,测定表达的荧光素酶活性。结果;当pSG5－VDR表达载体共转染时1,25一二羟维生素D3显著地抑制Caco－2细胞荧光素酶的表达;而未使用pSG5－VDR表达载体共转染时,则无抑制作用。说明1,25一二羟维生素D3能抑制报导载体pGL2荧光素酶的表达。类似于人类PTH基因中的潜在抑制性VDRE存在于报导载体pGL2。