肺癌相关蛋白的筛选与鉴定

目的:应用蛋白质组学方法筛选肺癌相关蛋白,为阐明肺癌发生的分子机制和预后研究提供理论依据. 方法: 收集8例手术切除的新鲜肺癌组织及同一患者手术切缘的癌旁组织,提取可溶性总蛋白. 应用等电聚焦(IEF)电泳和十二烷基磺酸钠聚丙烯酰凝胶电泳(SDS-PAGE)技术将可溶性总蛋白分离,得到肺癌的蛋白质组分析型双向电泳图谱,经PDQuest凝胶图像分析软件分析后找出差异蛋白点. 胶内酶解差异表达的蛋白点,基质辅助电离解析飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)获得肽质量指纹图谱(PMF),搜寻蛋白质数据库,并运用生物信息学鉴定蛋白质,分析蛋白的生物学意义和生物学功能,作为肺癌标志物的候选蛋白. 结果: 分别将8例肺癌组织及配对的癌旁组织可溶性总蛋白经过重复3次双向电泳,建立了肺癌组织蛋白质表达谱. 经PDQuest凝胶图像分析软件进行分析后, 12个蛋白质斑点只在肺癌组织有表达;6个蛋白质斑点只在癌旁表达. 对高丰度的肺癌特异表达的蛋白点进行鉴定,结果表明这些特异蛋白分别为钙粒蛋白B,Calgizzarin,载脂蛋白A-I,载脂蛋白E,Ras相关蛋白Rab-14,亲环素. 结论: 建立了人肺癌组织和癌旁组织的双向电泳图谱,为建立相应的蛋白质数据库提供了基础数据;鉴定了钙粒蛋白B等肺癌相关蛋白质,为进一步寻找肺癌蛋白标志物奠定了基础,对阐明肺癌发生的分子机制和预后研究有重要理论意义.     

B72和hTERT的真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建同时表达B72和hTERT的真核表达载体.方法:根据GenBank中的序列,对B72、hTERT各设计一对两端带特定限制性酶切位点的引物,分别从乳腺组织、乳癌组织提取总RNA,进行RT-PCR后,将2扩增产物分别克隆在pGEM-T载体,然后双酶切各pGEM-T载体,回收目的片段,将2目的片段再克隆至真核表达质粒pEGFP-C3中,并对重组体进行PCR鉴定和测序分析.结果:PCR扩增片段与预期结果相符,B72/hTERT真核表达载体构建成功,插入片段测序结果与GenBank公布的基因一致.结论:成功构建B72/hTERT真核表达载体.     

幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位编码基因的克隆与序列分析

目的 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)热休克蛋白A亚单位的编码基因(hspA)克隆和序列分析，为H.pyiori基因工程疫苗的研究奠定基础。方法 应用PCR方法获得国内分离H.pylori菌株MEI，HP27和国际标准参考株H.pylori的hspA基因，通过定向克隆的方法分别插入克隆载体pNEB193中，用质粒酶切电泳和特异PCR方法鉴定重组质粒。克隆基因经测序后进行核苷酸和氨基酸的同源性比较。结果 重组质粒经双酶切后得到0．35kb的hspA基因片段，特异PCR可扩增出hspA基因片段，证实H.pylori hspA基因的重组克隆质粒构建成功。经测序，国内分离HpMEL-HP27的hspA基因全长357bp(Genbank收录号：AY295084)，编码由118个氨基酸残基组成的肽链，hspA基因序列与GenBank公布的H.pylorl相应基因同源性高达95．20％～97．48％，氨基酸序列同源性在95．76％～97．46％之间。结论 克隆了H．pylori菌株MEL-HP27的hspA基因，其核酸序列与国际参考株NCTC11637同源性为97．48％。     

基于课题驱动的预防医学毕业设计教学模式应用与质量评价

目的 探讨基于支撑课题的任务驱动教学法在预防医学毕业设计中的应用效果。方法 选择公共卫生学院预防医学五年级学生为研究对象,按学号分段将110名学生分为2组;观察组采用任务驱动教学法,对照组采取传统毕业设计教学方法,时间进度与观察组一致。通过毕业设计考核3层次评分和综合成绩进行教学质量评价。结果 观察组学生毕业设计第三方评阅人评分、答辩评分和综合成绩均高于对照组（P＜0.001）;观察组综合成绩学生优良人数分布优于对照组（P＜0.05）。结构性分析显示,评阅人评分的4项一级指标平均得分率,观察组均高于对照组（P＜0.05）;观察组学生的答辩小组评分“选题质量”、“能力水平”、“创新”和“问题回答”的平均得分率均值均高于对照组（P＜0.05）。结论 基于支撑课题的任务驱动教学法有助于促进毕业设计的选题质量,增强学生的创新意识和表达能力,提高毕业设计带教效果。     

幽门螺杆菌中国株cagA全长基因克隆及其分子特征分析

目的克隆幽门螺杆菌中国株MEL-Hp 27cagA全长基因,并进行分子特征分析。方法参考Hp26695基因组序列,分别针对cagA基因编码区保守序列和位于cagA基因上、下游的基因序列设计两对PCR引物,交叉分段扩增包括cagA基因编码区、5′、3′非编码区在内的全长基因序列,并对cagA基因调控序列、编码序列及源自中国的CagA分子EPIYA基序分布特点进行分析。结果Hp27cagA基因编码区长3510bp,编码1169个氨基酸。5′端非编码区长649bp,-10区、-35区分别位于起始密码子ATG上游89bp和154bp处,3′端非编码区长476bp。Hp27cagA基因编码区核苷酸序列与东亚菌株同源性为96%,与西方菌株的同源性仅为86%左右。Hp27CagA分子存在典型的EPIYA基序,属于ABD型,与国际参考株NCTC11637的AB-CCC型不同。比较源自中国的HpCagA序列的EPIYA基序分布特点,未发现中国Hp分离株之间存在CagAEPIYA基序与疾病结局(胃癌、慢性胃炎和十二指肠溃疡)的聚类关系。结论成功克隆幽门螺杆菌全长ca-gA基因;cagA基因编码区及非编码区序列存在东西方差异;未发现中国Hp分离株之间存在CagA EPIYA基序与疾病结局的聚类关系。     

幽门螺杆菌omp22基因工程菌蛋白表达条件优化、纯化及活性鉴定

[目的]优化幽门螺杆菌omp22基因工程菌(pMAL-c2X-omp22-TB1)的表达条件,并对目的蛋白进行纯化和免疫活性鉴定. [方法]在不同诱导时机、诱导剂(IPTG)浓度、诱导时间下诱导pMAL-c2X-omp22-TB1的表达,测定目的蛋白的表达量.在优化条件下诱导工程菌表达,采用SDS-PAGE方法对表达产物分析;Amyloss树脂预装柱对可溶性OMP22蛋白进行分离、纯化,对纯化蛋白做Westem blot分析. [结果]工程菌培养2 h时加入IPTG(终浓度为0.3mmol/L)诱导4 h,目的蛋白表达量达到菌体总蛋白的25%以上;经纯化得到了较高纯度(>90%)的目的蛋白,并具有良好的免疫原性. [结论]建立了从TB1(pMAL-c2X-omp22)可溶性表达产物中纯化较高纯度OMP22融合蛋白的方法,为进一步的动物实验和诊断性抗原的研制以及工程菌高效表达生产工艺的研究打下了基础.     

幽门螺杆菌黏附素HpaA蛋白在大肠杆菌中表达及其免疫保护作用

目的表达和纯化幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)黏附素HpaA蛋白,研究其免疫活性和对小鼠的免疫保护作用。方法诱导TB1(pMAL-c2X-hpaA)表达H.pylori黏附素HpaA蛋白,Amyloss树脂预装柱进行分离、纯化,Western blot鉴定其免疫学活性;纯化蛋白免疫小鼠后,H.pylori国际标准菌株NCTC11637攻击感染,观察H.pylori定植情况及免疫保护效果。结果获得了高纯度且免疫活性良好的目的蛋白;HpaA蛋白免疫小鼠的保护率为53.33%(8/15),与对照组统计学差异显著(P=0.002)。结论纯化HpaA蛋白对小鼠有免疫保护作用,可作为H.pylori基因工程疫苗的候选组分。     

幽门螺杆菌分离株iceA基因克隆及序列分析

目的 克隆幽门螺杆菌中国郑州市慢性萎缩性胃炎患者分离株MEL-Hp27 iceA基因,测序后对其进行序列分析.方法 根据iceA基因上下游基因序列设计引物,PCR扩增iceA基因,并将其连接至pMD19-T载体,测序后采用相关数据库和生物信息学软件对基因序列进行分析.结果 成功克隆幽门螺杆菌Hp27菌株iceA基因序列,扩增产物大小约为790 bp;重组质粒pMD19-T-iceA单酶切产生3 820 bp片段,双酶切产生3 000和820 bp的2个片段;Hp27iceA基因与大多数美国来源菌株同源性＞85%,与日本、印度等地区来源菌株同源性＜70%.序列分析结果表明,所克隆到的基因为iceA2亚型,与美国株Alaska strain 219、Alaska strain 213关系最近,同源性分别为87%和95%,与芬兰株Finland strain 9496等菌株存在聚类关系,同源性88%～93%,与CR9等其他菌株距离较远.结论 成功克隆幽门螺杆菌Hp27菌株iceA基因序列;不同地区幽门螺杆菌分离株的iceA基因间存在着一定差异.     

肺癌组织中蛋白质组双向电泳图谱分析方法的建立

目的：建立一套双向凝胶电泳图像的分析方法,为进一步分析和鉴定差异蛋白奠定基础。方法：提取肺癌组织和癌旁组织中的可溶性总蛋白,进行双向凝胶电泳,电泳图片由专用扫描仪获取后,应用图像分析软件(PDQuest 7.1)进行蛋白差异点的表达情况分析。结果：二维电泳图片经过背景消减、点检测、点匹配等一系列分析后,得出了差异点。结论：PDQuest 7．1软件可以用来快速有效地对生物样品之间蛋白质的差异进行分析。     

幽门螺杆菌外膜蛋白基因omp22克隆、表达和鉴定

目的:克隆幽门螺杆菌外膜蛋白基因omp22,构建幽门螺杆菌omp22基因与麦芽糖结合蛋白基因融合表达载体,并进行诱导表达,鉴定融合蛋白免疫原性,为幽门螺杆菌疫苗研究提供依据.方法:利用 PCR 技术从Helicobacter pylori郑州分离株MEL-Hp27染色体DNA上扩增omp22基因,并将其克隆到表达载体pMAL-c2X中,转化大肠杆菌(E.coli TB1),用IPTG诱导目的基因表达,SDS-PAGE方法对表达产物进行分析,Western blot鉴定其免疫原性.结果:PCR方法扩增的omp22基因长度约为540 bp.经酶切鉴定,插入到表达载体的基因片段与预期目的DNA片段相一致;SDS-PAGE结果显示表达产物分子量约为22 ku,融合蛋白的表达量约占全菌总蛋白的26%.结论:成功克隆并构建了omp22基因高效原核表达系统,为幽门螺杆菌基因工程组分疫苗的研究奠定基础.