幽门螺杆菌1pp20基因在大肠杆菌TB1中诱导表达方法的研究

目的 :研究影响幽门螺杆菌lpp2 0基因在大肠杆菌TB1中表达的因素 ,探索高效表达的条件 ,为幽门螺杆菌疫苗抗原的纯化和生产奠定基础。方法 :用PCR方法从幽门螺杆菌的染色体DNA上扩增出lpp2 0基因片段 ,将目的基因插入的表达载体pMAL c2X中 ,用重组质粒转化大肠杆菌 (E .coliTB1)。采用不同的诱导时间、IPTG浓度和诱导温度进行诱导表达 ,应用SDS PAGE方法对表达产物进行分析。结果 :在诱导 1～ 4h之间 ,融合蛋白的表达量变化较为显著 ,而 4～ 8h之间则无显著变化 ;IPTG终浓度低于 0 .2mmol/L或高于3 .2mmol/L均能显著减少融合蛋白的表达量 (P <0 .0 5 ) ,而IPTG终浓度在 0 .4～ 2 .4mmol/L之间时 ,对融合蛋白的表达量并无显著影响 ;诱导温度在 3 0℃～ 40℃之间变化对融合蛋白的表达量无显著影响 ,超出此范围可使表达量显著减少 (P <0 .0 5 ) ;在优化诱导条件后 ,融合蛋白的表达量可达全菌总蛋白的 3 4%。结论 :通过调整诱导时间、IPTG浓度和诱导温度 ,lpp2 0基因与载体pMAL c2X的重组质粒在E .coliTB1中能够高效表达。     

霍乱弧菌毒素协同调节菌毛基因tcpA的克隆及序列分析

目的 以新疆分离0139霍乱弧菌XJ93006株的DNA为模板,自行设计引物克隆毒素协同调节菌毛亚单位A(tcpA)基因(包括侧序列)并构建重组载体.方法以0139霍乱弧菌新疆分离株XJ93006基因组DNA作为模板;根据Ol群E1Tor型霍乱弧菌N16961全基因组序列设计tcpA PCR引物,高保真酶扩增tcpA片段:限制性内切酶切PCR产物和pNEBl93空质粒,T4DNA连接酶连接酶切产物,重组质粒转化大肠杆菌TB1工程菌,蓝白斑菌落试验筛选阳性克隆;提取质粒经酶切鉴定后测序并利用生物信息数据库对该序列进行序列分析,比较.结果DNA限制性内切酶可从重组质粒pNEBl93-tcpA的EcoRⅠ和SalⅠ位点之间切出一个1037bp的DNA片段,测序结果与O1群E1Tor型霍乱弧菌N16961、O139霍乱弧菌标准株M045的tcpA同源性均达到99.9%以上.结论成功构建O139霍乱弧菌新疆分离株XJ93006毒素协同调节菌毛亚单位A(tcpA)基因的重组质粒pNEBl93-tcpA;序列分析表明霍乱弧菌毒素协同调节菌毛亚单位A(tcpA)基因在O1群EITor型霍乱弧菌和O139霍乱弧菌中是一类高度保守的原核基因,可作为霍乱弧菌疫苗的候选基因.另外为研究O139霍乱弧菌的来源奠定基础.     

幽门螺杆菌的分子分型及其分子流行病学研究

目的在基因分型基础上探讨不同基因型别的幽门螺杆菌(Hp)与疾病之间的关系。方法采用随机扩增的多态性DNA(RAPD)和PCR-RFLP法对50株来自不同病人的Hp进行分析,在此基础上运用聚类分析进行基因分型,并用病例对照研究探讨不同基因型别的Hp与疾病之间的关系。结果RAPD结果显示,不同基因型别的Hp与不同的疾病结局有关。PCR-RFLP结果显示,单个基因的分析结果均未能说明不同基因型别的Hp与不同的疾病结局有关,而多个基因的综合分析结果则说明不同基因型别的Hp确实与不同的疾病结局有关。将RAPD和PCR-RFLP的分析结果进行综合分析,也从多方法水平说明不同基因型别的Hp确实与不同的疾病结局有关。结论对于Hp来说,多基因性状数值分类法的分型效率高于单基因数值分类法,这为建立Hp的多基因、多方法的数值分类系统打下了基础。     

志贺菌耐多药外排泵emrE基因作用分析

目的 对临床耐多药志贺菌株H24的1种小多重耐药性家族(SMR)外排泵emrE基因进行定向分子进化,研究基因突变增强emrE外排泵耐药性的潜力,调查志贺菌外排泵基因emrE基因垂直进化对临床耐药发展的影响。方法 通过用体外易错PCR(EP-PCR)方法对emrE基因进行随机突变实验,用微量稀释生长曲线法进行菌株的耐药性筛选,用荧光实时定量RT-PCR测定基因表达情况,应用DNA分析软件DNAStar进行生物信息学分析。结果 在31个突变子中筛选到了突变子ep2-emrE(DH5α),它的emrE基因有6个氨基酸突变,分别为Thr-28→Ala,Cys-39→Ser,Tyr-40→终止子,Ser-72→Arg,Leu-93→Phe,Ile-101→Phe。它不但增强四环素和红霉素的耐药能力,还产生新的氯霉素耐药能力。结论 尽管emrE基因较易获得新增耐药性,但在志贺菌对四环素、红霉素等抗生素耐药性发展中,emrE基因的进化突变没有被筛选,表明有其他能力更强的耐药基因在突变进化中起作用。     

霍乱弧菌O139和El Tor菌株tcpA分子特征的研究

[目的]从霍乱弧菌XJ93006、MO45、XJ89079中克隆毒素协同调节菌毛亚单位A（tcpA）基因（包括侧序列）并测序比较。[方法]PCR扩增tcpA片段;克隆该片段;提取质粒经鉴定后测序并利用DNAMAN对该序列进行序列分析,比较。[结果]成功构建XJ93006、MO45、XJ89079 tcpA基因的重组质粒。三株霍乱弧菌及与N16961 tcpA基因及其两侧核酸序列同源性XJ89079和N16961为100%,XJ93006和XJ89079为99.8%,XJ93006和MO45为99.5%,XJ89079和MO45为99.7%。[结论]该研究初步认为我国新疆VC O139与本地EVC关系密切。     

利用生物信息学分析幽门螺杆菌Lpp20蛋的化学和免疫学分子特征

目的分析幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)郑州分离株MEL-HP27Lpp20蛋白的主要化学和免疫学分子特征,为Hp基因工程疫苗和诊断抗原的研究奠定基础。方法根据本研究室克隆的HpMEL-HP27lpp20基因的核苷酸序列推导出该基因表达产物(Lpp20)的氨基酸序列,应用生物信息学软件Omiga2.0、Anthepro4.5和GenBank数据库对Lpp20分子的主要化学特征和抗原活性进行分析。结果MEL-HP27Lpp20蛋白的氨基酸序列长度为175aa,Lpp20蛋白的分子量为19.122kDa,等电点为9.950,pH7.0时带电荷为9.035,280nm摩尔消光系数为12210,280nm吸光度为0.639,具有2个有抗原活性的结构域。结论MEL-HP27Lpp20蛋白分子具有典型抗原分子的结构特征,有希望成为新的Hp疫苗候选抗原。     

蟒河污染对人群死亡率的影响

采用回顾性调查方法，对黄河支流———蟒河污染区及对照区居民进行了１０万人年的死因回顾性调查。结果显示：２区人群在总死亡率、死因顺位和年龄别死亡率等方面差异无显著性；污染区男性恶性肿瘤死亡率高于对照区，但差异无显著性；污染区女性恶性肿瘤（以食管癌为主）及呼吸系统疾病死亡率高于对照区，差异有显著性。这表明虽然蟒河污染对沿岸居民总体死亡水平尚未造成影响，但已对恶性肿瘤的发生起到了促进作用     

志贺菌属整合子的耐药贡献与稳定性研究

目的分析志贺菌属整合子对耐药性的贡献及其稳定性。方法对志贺菌属1类、2类整合子的耐药基因盒分别克隆、转化DH5α,观察阳性克隆菌对多种抗生素敏感性的变化。将整合子阳性克隆菌与多重耐药志贺菌进行质粒接合实验,并测定耐药性的改变。对10株耐药谱不同、携带整合子不同的志贺菌属细菌进行无抗生素压力下连续多次传代实验,检测其耐药性及整合子的变化。结果志贺菌属1类整合子耐药基因盒dfrA17-aadA5阳性克隆菌对链霉素和甲氧苄啶的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)分别提高了8倍和32倍;2类整合子耐药基因盒dfrA1-sat1-aadA1阳性克隆菌对链霉素和甲氧苄啶的MIC分别提高了64倍和32倍;整合子阳性克隆菌经质粒接合传递后对抗生素的MIC无改变。1株携带2类整合子的志贺菌属菌株经过多次传代培养后丢失整合子及其耐药性。结论志贺菌属整合子-耐药基因盒系统可引起特定抗生素的耐药性,对质粒接合传递耐药性无影响。志贺菌属的2类整合子可发生丢失。     

中国幽门螺杆菌cagA基因敲除突变株生物学特性分析

细胞毒素相关基因A蛋白（cytotoxin-associatedgeneA，CagA）是幽门螺杆菌（Hp）最重要的毒力因子之一。流行病学研究认为，CagA阳性肋感染与消化性溃疡和胃癌发生的关系比CagA阴性菌株更为密切，提示CagA可能是一种重要的疾病相关蛋白，在坳致病过程中发挥作用。由于却菌株自身的变异，CagA阳性株与CagA阴性株间除CagA基因外存在许多差异之处，因此，在自然状态下很难对CagA基因功能做出真实判断。     

新疆O139群霍乱弧菌93006菌株基因组文库的构建

目的：构建我国新疆分离O139群霍乱弧菌菌株(93006菌株)的基因组文库,为研究我国O139群霍乱弧菌的来源及其基因组特征提供资料。方法：制备霍乱弧菌高相对分子质量的基因组DNA,用Sau3AI酶将基因组。DNA部分酶切成平均大小为32∽40kb的片段,将部分酶切并经碱性磷酸酶(CIAP)处理的DNA片段与经XbaI、CIAP、BamHI处理的粘粒载体SuperCosl的载体臂相连接,连接产物经体外包装并转染大肠杆菌XL-BluelMR,经氨苄抗性筛选得到阳性克隆,构建霍乱弧菌的基因组文库。结果：该文库共获得了1200个单克隆,平均插入片段的大小为32kb,空载率为0．05％,相当于9个库容量,从本文库中筛选到任一霍乱弧菌的DNA单拷贝序列的机率为99．98％,该文库能承受7次反复冻溶。结论：成功构建了我国新疆分离O139群霍乱弧菌菌株93006的基因组文库,为进一步克隆霍乱弧菌的基因和研究我国O139群霍乱弧菌的来源奠定了基础。