S100A6上调人乳腺癌细胞系MCF-7中β-catenin及其机制

目的 探讨钙细胞周期蛋白S100A6对人乳腺癌细胞系MCF-7中β-catenin的影响及其机制.方法 分别用表达S100A6及其siRNA的重组腺病毒AdS100A6与AdsiS100A6处理MCF-7细胞,RT-PCR、Western blot和免疫细胞化学检测β-catenin、E-钙黏蛋白(E-cadherin)和磷酸化糖原合酶激酶3β(p-GSK3β)表达或分布的变化.结果 在MCF-7细胞中,S100A6可以上调β-catenin的蛋白表达水平(P＜0.01),但对其mRNA表达无显著性影响;S100A6对E-cadherin的mRNA表达、蛋白质表达水平及分布均无显著性影响;S100A6可以提高β-catenin降解复合体的主要成员GSK3β磷酸化水平(P＜0.01).结论 S100A6上调β-catenin的可能机制是通过促进GSK3β磷酸化失活,而不是通过调节E-cadherin实现的.     

BMP9促进间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化的研究

目的确认骨形态发生蛋白9(Bone Morphogenetic Proteins 9,BMP9)是否促进间充质干细胞C3H10T1/2定向成骨分化,并初步探讨其分子机制。方法用重组鼠BMP9蛋白处理C3H10T1/2细胞。化学发光法检测碱性磷酸酶(ALP)活性;免疫组化检测骨桥素(OPN)的表达;茜素红S染色检测细胞钙盐沉积;Western Blot检测转录因子Smad1/5/8的磷酸化情况。结果 BMP9可以诱导C3H10T1/2细胞早期成骨指标ALP的活性,也可促进晚期成骨指标OPN的表达和钙盐沉积;BMP9刺激后,C3H10T1/2细胞中转录因子Smad1/5/8的磷酸化水平增加。结论 BMP9可以促进间充质干细胞C3H10T1/2定向成骨分化。     

以建构主义理论为指导,构建《临床检验基础》多维教学模式

【】 建构主义理论的核心就是“以学生为中心,强调学生对知识的主动探索、主动发现和对所学知识意义的主动建构”。以此理论为指导,在《临床检验基础》课程上构建基于课堂教学、网络平台和创新实验的三维立体教学模式,使学生在教学活动中不再是被动接受者,而是积极主动的参与者。实践表明,这种模式不但培养了学生的学习兴趣,同时也提高了学生的自主学习能力和创新能力,使学生的综合素质得以提高。     

骨形成蛋白的信号通路及其与骨形成的关

骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs),属于转化生长因子-β(TGF-β)蛋白超家族成员,具有重要的促骨生长及成骨分化特性.其中BMPs信号转导途径扮演着重要角色,然而BMPs又是通过Smad途径和MAPK途径激活下游信号途径而发挥作用.本文着重阐述BMPs信号通路及其与骨形成的关系.     

双氢青蒿素对人骨肉瘤细胞株143B增殖和凋亡的作用

目的观察双氢青蒿素(dihydroarteminin,DHA)对人骨肉瘤细胞143B的增殖和凋亡的影响以及可能的机制。方法体外培养人骨肉瘤细胞株143B;MTT比色法和克隆形成实验检测不同浓度DHA对骨肉瘤细胞存活与克隆形成能力的影响。Hoechst 33258染色法观察细胞凋亡的形态变化。构建β-Catenin荧光素酶报告基因(β-Catenin-Luc,p-Top)检测DHA作用143B后细胞内β-Catenin活性变化。不同浓度的DHA作用后,Western blot检测与细胞增殖(如PC-NA、Cyclin D1、c-Myc)、凋亡(如Bad、Bcl-2、Caspase-3)密切相关的标志物蛋白质表达变化。结果 DHA作用于143B细胞24 h后,MTT结果显示143B细胞的增殖活性受到明显抑制,且其克隆形成能力减弱(P<0.05),在DHA浓度达35μmol.L-1时,抑制效率最明显。Western blot结果显示PC-NA表达下调;而促凋亡蛋白Bad和Caspase-3表达上调,Bcl-2蛋白表达明显减弱。结论双氢青蒿素具有较明显的抑制人骨肉瘤细胞的增殖且促进其凋亡的作用,可能通过下调细胞增殖相关蛋白PCNA、Bcl-2和上调促凋亡蛋白Bad和Caspase-3,启动凋亡程序,致143B细胞发生凋亡。     

实时逆转录PCR

实时RT PCR是一种新技术 ,它利用荧光实时检测PCR反应 ,灵敏度高、特异性好、节约时间。本文对分子灯塔、DNA结合染色、杂交探针和水解探针四种方法的原理、特点作了简要的介绍。并比较了三种可供选择的仪器 ,即ABIPrism770 0、Lightcycler和BioradiCycler各自的特点。使用特定的仪器、选择不同的实时RT PCR策略 ,可以将实时RT PCR应用于绝对定量、检测点突变和等位基因、mRNA结合变量 ,并可通过优化设计 ,实现多重RT PCR     

BMP-9基因修饰的骨髓基质细胞促进山羊骨缺损愈合

目的观察BMP-9基因修饰的骨髓基质细胞(marrow stromal cells,MSCs)治疗山羊骨缺损的效果。方法 12只12～18月龄中国青山羊,股骨中段建立临界骨缺损模型,按照配对比较法随机分为2组,缺损区域明胶海绵填充,实验组加入预先准备好的BMP-9腺病毒感染的MSCs悬液,对照组加入GFP腺病毒感染的MSCs悬液,术后1 d、2、4、8、12、20周行X线片检查,20周时进行CT检查,处死动物,行大体标本、组织学染色和生物力学的检测。结果 X线片显示实验组较对照组骨痂形成更早更多,大体标本、组织学染色显示实验组的新生骨更加成熟,CT显示实验组新生骨塑形更好,生物力学检测显示实验组新生骨痂的力学强度更强。结论 BMP-9基因修饰的MSCs可以有效地促进山羊股骨骨缺损的愈合。     

DLL1在骨形态形成蛋白9诱导骨髓间充质干细胞成骨分化中的作用

目的 探讨Notch配体Delta-like1(DLL1)在骨形态形成蛋白9(bone morphogenetic proteins 9,BMP9)诱导的骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成骨分化中的作用及机制.方法 利用DLL1重组腺病毒上调永生化小鼠胚胎成纤维细胞(immortalized mouse embryonic fibroblasts,iMEF)中DLL1 mRNA的表达,分别采用细胞化学染色、活性测定对早期成骨指标碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和晚期成骨指标钙盐沉积的影响;其次裸鼠皮下异位成骨实验进一步了解DLL1的体内成骨作用;最后用qRT-PCR、Western blot和荧光素酶检测DLL1对BMP9经典信号通路中Ⅰ型受体、Smad1/5/8磷酸化和Smad结合元件(smad-binding element,SBE)转录活性影响.结果 与对照组相比,DLL1在体外能明显促进BMP9诱导的MSCs早期成骨指标ALP活性和晚期成骨指标钙盐沉积的生成;同时也能明显促进BMP9诱导的MSCs裸鼠皮下异位成骨作用;BMP9信号通路中ALK2表达明显增加,而对ALK1则没有影响;Smad1/5/8蛋白量没有明显变化,而p-Smad1/5/8蛋白及SBE活性明显增加(P＜0.05).结论 DLL1可以促进BMP9诱导的MSCs成骨分化,可能通过影响BMP9信号通路来实现其促成骨作用.     

石蒜碱通过调控MAPK/ERK信号通路抑制人结肠腺癌LoVo细胞生长

目的:探讨石蒜碱(lycorine)对人结肠腺癌LoVo细胞活力、凋亡和迁移侵袭能力的影响及其作用机制。方法:不同浓度(1~8μmol/L) lycorine处理LoVo细胞,CCK-8法检测细胞活力;划痕愈合和Transwell小室实验检测迁移和侵袭能力;Hoechst染色及流式细胞术实验检测凋亡改变;萤光素酶报告基因系统检测MAPK/ERK信号通路活化情况;同时采用Western blot法检测增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)、上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)相关标志物、凋亡相关蛋白及磷酸化ERK1/2蛋白水平的变化。结果:与空白对照组相比,lycorine处理组LoVo细胞的活力和迁移侵袭能力受到显著抑制(P<0.05),同时EMT相关标志物基质金属蛋白酶7(matrix metalloproteinase-7, MMP-7)和N-cadherin表达下调,E-cadherin表达上调(P<0.05),而凋亡细胞数及cleaved caspase-3无显著差异(P>0.05)。此外,lycorine处理组Elk1/SRF转录活性降低,ERK1/2磷酸化水平降低(P<0.05)。结论:石蒜碱可通过调控MAPK/ERK信号通路及抑制EMT过程LoVo细胞的活力及迁移侵袭能力,从而在体外主要发挥生长抑制的抗肿瘤作用。     

GST-hS100A9融合蛋白的原核表达、纯化及鉴定

目的制备GST-hS100A9融合蛋白。方法从pHAHA-hS100A9中PCR扩增获取hS100A9基因,亚克隆至原核表达载体pGST-moluc,构建pGST-hS100A9;后者转化BL21菌后,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组菌表达融合蛋白GST-hS100A9,经谷胱甘肽-琼脂糖4B球珠(GS4BB)分离纯化、SDS-PAGE及Western blot鉴定,BCA法蛋白定量,CCK-8测定GST-hS100A9对乳腺癌细胞MCF-7增殖的作用。结果经酶切、测序分析证实pGST-hS100A9质粒构建正确;重组菌株经IPTG诱导后,表达相对分子质量约36 000的蛋白;纯化后纯度达94%;该蛋白可被S100A9的抗体特异识别;该蛋白产量约为20 mg/L菌液;且其抑制MCF-7的增殖。结论成功构建GST-hS100A9融合蛋白的原核表达质粒pGST-hS100A9;该质粒可在BL21中诱导表达GST-hS100A9,产率高,且对MCF-7增殖有抑制作用。