骨形态发生蛋白9对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein9,BMP9)在体内、外对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖和凋亡的影响。方法:将pAdtrack-CMV/BMP9和pAdtrack-CMV/GFP腺病毒感染MDA-MB-231细胞,RT-PCR法检测MDA-MB-231/GFP和MDA-MB-231/BMP9细胞中BMP9mRNA的表达,MTT法、平板集落形成实验和FCM法检测细胞增殖和凋亡的情况。建立裸鼠MDA-MB-231、MDA-MB-231/GFP和MDA-MB-231/BMP9移植瘤模型,测量移植瘤体积,TUNEL法检测肿瘤细胞的凋亡情况。结果:MDA-MB-231和MDA-MB-231/GFP细胞中无BMP9mRNA的表达,MDA-MB-231/BMP9细胞中有明显BMP9mRNA表达;MDA-MB-231/BMP9细胞增殖抑制率高于MDA-MB-231/GFP细胞(P<0.05),而细胞集落形成率明显低于MDA-MB-231/GFP和MDA-MB-231组(P<0.05),细胞凋亡率则明显高于MDA-MB-231/GFP和MDA-MB-231组(P<0.05)。MDA-MB-231/BMP9组的裸鼠移植瘤体积明显小于MDA-MB-231/GFP和MDA-MB-231组(P<0.001),而移植瘤细胞中的凋亡指数则明显高于MDA-MB-231/GFP和MDA-MB-231组(P<0.001)。结论:BMP9可在体内、外抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖并促进其凋亡。     

外源性S100A8在体外抑制HeLa细胞的增殖和侵袭

目的探讨外源性S100A8对宫颈癌细胞系HeLa的增殖、凋亡、克隆形成及迁移和侵袭的影响。方法 MTT法检测细胞增殖活性;Hoechst染色检测细胞凋亡;流式细胞技术检测细胞周期;平板集落形成实验检测细胞集落形成;划痕和Transwell侵袭实验分别检测细胞的迁移和侵袭。结果细胞培养3 d时,浓度为100、300和1 000 mg/L的GST-hS100A8组的A值较GST组减少13.64%、19.29%和25.06%(P<0.05);在浓度为100 mg/L时,GST-hS100A8组呈时间依赖性减少(P<0.05);GST-hS100A8组在第3天时细胞凋亡率较GST组增加5.18倍(P<0.05),同时,出现峰值为(19.9±0.76)%的凋亡峰,而对照组没有凋亡峰;GST-hS100A8组的集落形成率较GST组减少30.2%(P<0.005);划痕愈合率较GST组降低30.1%(P<0.05);穿膜细胞数减少48.9%(P<0.05)。结论外源性S100A8可能具有抑制宫颈癌的作用。     

实时逆转录PCR

实时RT－PCR是一种新技术，它利用荧光实时检测PCR反应，灵敏度高、特异性好、节约时间。本文对分子打塔、DNA结合染色、杂交探针和水解探针四种方法的原理、特点作了简要的介绍。并比较了三种可供选择的仪器，即ABI Prism 7 700、Lighteycler和Biorad iCycler各自的特点。使用特定的仪器、选择不同的实时RT－PCR策略，可以将实时RT－PCR应用于绝对定量、检测点突变和等位基因、mRNA结合变量，并可通过优化设计，实现多重RT－PCR。     

肺炎链球菌感受态的形成影响毒力因子mRNA的表达

目的：通过体外实验诱导的转化过程，探索肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae,S.pn)毒力因子的表达是否与环境诱导细菌感受态形成与转化有关。方法：采用插入失活的方式断裂S.pn感受态形成的关键基因comE，获得感受态缺陷菌株。以实时定量RT－PCR测定毒力因子在感受态缺陷菌与野生菌的表达是否存在差异。所测毒力因子有自溶酶、溶血素、胆碱结合蛋白、S-IgA、神经氨酸酶、透明质酸酶。结果：S.pn在540nm处吸光度（A）值＝0.044－0.127之间产生感受态。自溶酶、神经氨酸酶、透明质酸酶3种毒力因子的表达，野生菌组表达高于缺陷菌组，两均数间比较的t值分别为2．96（P＜0．05）、2．8（P＜0．05）、4．56（P＜0．05）。结论：细菌感受态能启动自溶酶、神经氨酸酶、透明质酸酶3种毒力因子的表达，提示S.pn的感受态能影响其毒力因子的表达。     

肺炎链球菌实验室转化模型的方法学研究

目的 建立肺炎链球菌的实验室转化模型,以便于对该菌的各种目的基因进行重组改造。方法 通过检测细菌的吸光度值,在特定的菌密度时利用感受态刺激因子(CSP)诱导,采用血平板培养筛选的方法,获取发生转化了的菌株。通过抗生素培养基培养和PCR鉴定是否发生转化。结果 发现不同肺炎链球菌株的转化最适菌密度不同,构建了肺炎链球菌感受态缺陷菌株,建立了肺炎链球菌在实验室的转化模型。结论 实验室条件下,在不同菌密度时可利用CSP诱导肺炎链球菌成为感受态而发生转化。     

肺炎链球菌实验室转化模型的方法学研究

目的 建立肺炎链球茵的实验室转化模型，以便于对该茵的各种目的基因进行重组改造。方法 通过检测细菌的光妻当竺，皇冀定的茵密度时利用感受态刺激因子(CSP)诱导，采用血平板培养筛选的方法，获取发生转化了的菌株。通过抗生素培养基和PCR鉴定是否发生转化。结果 发现不同肺炎链球菌株的转化最适茵密度不同，构建了肺炎链球菌感受态缺陷菌株，建立了肺炎链球菌在实验室的转化模型。结论 实验室条件下，在不同茵密度时可利用CSP诱导肺炎链球菌成为感受态而发生转化。     

肺炎链球菌毒力因子PspA的原核表达、纯化及鉴定

目的:通过构建原核表达载体,获得肺炎链球菌毒力因子PspA重组蛋白.方法:分离培养肺炎链球菌TIGR4,获取其染色体DNA,采用基因体外重组法将PspA序列克隆到原核表达载体PET-32(a)上,用酶切及测序鉴定.将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,进行蛋白纯化,获得的重组蛋白用SDS-PAGE和Western blot鉴定.结果:克隆的DNA序列与GenBank中的数据相符,获得的重组蛋白PspA纯度达到90%.结论:成功表达和纯化了PspA,为肺炎链球菌多肽联合疫苗研制和该蛋白的结构生物学分析奠定了基础.     

骨形成蛋白的信号通路及其与骨形成的关系

骨形成蛋白（bone morphogenetic proteins,BMPs）,属于转化生长因子-β（TGF-β）蛋白超家族成员,具有重要的促骨生长及成骨分化特性。其中BMPs信号转导途径扮演着重要角色,然而BMPs又是通过Smad途径和MAPK途径激活下游信号途径而发挥作用。本文着重阐述BMPs信号通路及其与骨形成的关系。     

Runx3敲减抑制BMP9诱导小鼠胚胎成纤维细胞iMEFs向成骨分化

目的研究Runx3敲减对BMP9诱导的小鼠胚胎成纤维细胞iMEFs成骨分化的作用。方法 BMP9腺病毒感染iMEFs,用Western blot检测内源性Runx3蛋白的表达。Runx3干扰腺病毒ad-siRunx3和BMP9条件培养基共同处理iMEFs,用碱性磷酸(ALP)染色和活性定量测定检测成骨早期指标ALP;用茜素红S染色检测成骨晚期指标钙盐沉积;用RT-PCR检测成骨相关基因Id1、Id2、Id3和Runx2,用Western blot检测成骨相关蛋白Dlx5;用SBE荧光素酶报告质粒检测smad1/5/8的转录活性。结果 BMP9可以使Runx3表达降低(P0.05);干扰Runx3可以抑制早期成骨指标ALP活性(P0.05)和晚期成骨指标钙盐沉积;ad-siRunx3抑制BMP9诱导的成骨相关转录因子Id1、Id2、Id3和Runx2基因的表达(P0.05)及DLX5蛋白的表达(P0.05)。结论敲减Runx3可以抑制BMP9诱导小鼠胚胎成纤维细胞向成骨分化。     

穿心莲内酯对骨肉瘤143B细胞的抑制作用及其机制

目的:探究穿心莲内脂(AG)对人骨肉瘤143B细胞的抑制作用及其潜在的机制。方法:体外培养人骨肉瘤143B细胞,使用不同浓度(0~20μmol/L)的AG处理143B细胞,分别用结晶紫染色、MTT法和集落形成实验来检测AG对143B细胞增殖的影响。划痕愈合实验检测骨肉瘤143B细胞的迁移能力。Transwell小室实验检测骨肉瘤143B细胞的侵袭能力。Hoechst 33258染色实验和流式细胞术检测AG对骨肉瘤细胞凋亡的影响。不同浓度AG处理后,使用Western blot检测骨肉瘤细胞增殖、迁移侵袭和凋亡相关蛋白的水平。应用Western blot进一步检测Wnt信号通路中的β-catenin及其相关分子c-Myc的表达量。结果:与空白组相比,AG处理组中143B骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力明显受到抑制(P<0.05),且呈浓度依赖性。迁移侵袭相关蛋白基质金属蛋白酶9(MMP-9)、波形蛋白(vimentin)和Snail蛋白的水平均下调(均P<0.05),抗凋亡蛋白Bcl-2表达量升高,凋亡相关蛋白caspase-3的蛋白水平下降而cleaved caspase-3的蛋白水平升高,同时Wnt信号通路相关蛋白β-catenin和c-Myc的表达水平均明显下调(P<0.01)。结论:穿心莲内酯可能通过抑制Wnt信号通路的活性,从而达到抑制人骨肉瘤143B细胞增殖、迁移和侵袭能力,并且促进其凋亡。