快速成型骨组织工程支架的结构及力学仿生性能特征

目的:利用显微CT的成像技术及材料力学测试,观察多孔双相磷酸钙陶瓷支架的三维结构和力学仿生性能特征。方法:实验于2004-06/2005-12在清华大学新型陶瓷与精细工艺国家重点实验室、香港中文大学威尔士亲王医院骨与关节肌肉研究室和解放军总医院骨科研究所完成。利用三维凝胶叠层成型技术和发泡法复合的方法,制备仿骨多孔双相磷酸钙陶瓷支架,经显微CT扫描得到分辨率为20μm的断层图像,并按骨形态计量方法计算三维计量参数,并与急性脑死亡年轻人股骨头(由解放军总医院骨组织库提供,已签署捐献同意书)标本负重区松质骨样本的三维参数进行统计比较。最后对双相磷酸钙陶瓷支架两个互相垂直方向和松质骨样本的长轴方向进行压缩强度试验,计算压缩强度和弹性模量,并进行统计分析。结果:①双相磷酸钙陶瓷支架的小梁平均宽度和间距低于松质骨小梁(P<0.05);支架的小梁数目和各项异性程度高于松质骨样本(P<0.05);说明支架小梁在排列上呈现更为明显的各向异性特征。②双相磷酸钙陶瓷支架的体积分数、表面积体积比及结构模型指数与松质骨样本相比差异无显著性(P>0.05),两组样本均呈明显的板层结构。③力学测试结果显示双相磷酸钙陶瓷支架材料长轴方向的强度和弹性模量高于垂直方向(P<0.05),说明支架材料具有明显的方向性。长轴方向的强度低于正常松质骨样本,但弹性模量仅比松质骨样本弹性模量高20%(P<0.05)。结论:支架材料在空隙率和表面积方面具有很好的仿生性,利于细胞的黏附和长入。同时具有明显的方向性,提高了其在排列方向上的强度。弹性模量接近股骨头松质骨,具有较好的应力顺应性。     

应用于现代战创伤的急救止血剂

据统计,战伤死亡的人群中约有50％是死于不可控制的出血;在和平时期,出血也是创伤致死的第二大原因.即便最终控制了出血,如果不够及时,也会导致出现低体温、凝血功能障碍、感染、酸中毒以及多器官功能衰竭等多种严重并发症而危及伤者生命.因此,及时有效地控制出血,不论对于平时还是战时都意义重大.尽管许多肢体的出血可以通过上止血带来控制,但仍有许多特殊部位的出血,如胸腹部、腋窝、腹股沟等无法使用止血带.通常这些部位的出血改用纱布填塞的方法来压迫止血,但往往效果不佳[1].鉴于此,许多急救止血剂应运而生,旨在压迫止血的同时触发凝血的瀑布级联反应,从而更有效地止血[2].本文将针对目前应用的几种主要急救止血剂的特点、应用、存在的不足及可能的改进方向进行综述.     

软骨素酶ABC增加化学去细胞异体神经修复神经缺损长度的实验研究

目的应用软骨素酶ABC去除化学去细胞异体神经中不利于神经再生的物质——硫酸软骨素蛋白多糖(CSPG),修复大鼠坐骨神经长距离缺损,评价去除CSPG对修复缺损距离的影响。方法经软骨素酶ABC处理后化学去细胞异体神经修复大鼠20mm坐骨神经缺损为实验组(A组),对照组为未经酶处理的化学去细胞异体神经移植组(B组),术后3个月,评价其修复周围神经缺损的效果。结果术后3个月,两组都出现残足情况,A组仅一只大鼠出现残足,而B组6只大鼠出现残足。据Wall自残标准评分,两组进行等级资料秩和检验,两者之间具有统计学差异(P<0.05)。术后3个月,A组10只大鼠8只出现钳夹痛觉实验阳性,而B组仅1只大鼠出现阳性反应,两组之间具有显著性差异(χ2=4.42,P<0.05)。在小腿三头肌肌张力恢复率和小腿三头肌肌湿重方面,两组比较A组均优于B组(P<0.05)。进行近端与远端吻合口HE染色A组神经纤维结构优于B组。结论经软骨素酶ABC处理的化学去细胞异体神经可以有效地增加修复周围神经缺损的长度。     

锶盐预防创伤性股骨头坏死塌陷作用的初步研究

[目的]观察氯化锶用于预防股骨头坏死塌陷的作用效果及作用机制。[方法]雄性SD大鼠24只,分为3组:假手术组,安慰剂组和氯化锶治疗组。假手术组为正常对照组,安慰剂组在建立股骨头坏死模型后给予生理盐水治疗,氯化锶治疗组在建立股骨头坏死模型后给予氯化锶治疗。术后5周处死,取术侧股骨分别行X线片、Micro-CT和组织学检查。[结果]X线片检查显示股骨头高度与宽度比值安慰剂组<氯化锶治疗组<假手术组,且两两比较均有统计学差异。Micro-CT检查比较三组间股骨头的体积、股骨头内骨量、股骨头骨矿盐含量治疗组和假手术组相比无统计学差异,但都大于安慰剂组。组织学检查显示氯化锶治疗组股骨头内存在坏死骨,与安慰剂组相比,破骨细胞活动减低,而成骨细胞以及血管新生均较活跃。[结论]锶盐可以实现促进成骨和抑制破骨的双重调节,在大鼠创伤性骨坏死模型中具有一定程度预防股骨头坏死塌陷的作用。     

脐带Wharton胶干细胞外基质的制备及其细胞相容性观察

[目的]建立制备脐带Wharton胶干细胞细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的方法并对其生物相容性进行观察。[方法]无菌条件下收集人脐带组织,采用酶消化法分离培养脐带干细胞,使用普通培养基培养7 d后,在原培养基中添加抗坏血酸,再连续培养8 d;加入含有0.5%Triton X-100和20 mM NH 4OH的PBS溶液进行脱细胞处理后,用Hoechst 33258染色观察其DNA残留,采用扫描电镜对其微结构进行观察,通过天狼星红、甲苯胺蓝、番红花O组织学染色和I型胶原、II型胶原、纤维粘连蛋白及层粘连蛋白免疫荧光染色观察微载体的主要成分;将异体脐带干细胞种植在无细胞核DNA残留的ECM上,通过MTT法观察脐带干细胞的增殖生长情况。[结果]通过本实验方法得到的天然脱细胞脐带干细胞ECM,表面无细胞及DNA残留,整体表面有细胞陷窝形成,基质紧密连接。Hoechst 33258荧光染色阴性;天狼星红、甲苯胺蓝和番红花O组织学染色阳性;I型胶原、II型胶原、纤维粘连蛋白和层粘连蛋白免疫荧光染色阳性;在MTT检测细胞增殖中,种植于该ECM上的异体脐带干细胞组的OD值高于单纯平面培养组(P<0.05)。[结论]此次实验所得的脱细胞脐带干细胞外基质具有良好的生物相容性,能够为组织工程提供高质量的种子细胞,有望成为组织工程种子细胞的新型培养载体。     

安顺市吸毒人群HIV与肝炎病毒及梅毒感染调查

人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)、丁型肝炎病毒(hepatitis D virus,HDV)与梅毒螺旋体(Trepenema palidun,TP)均可以通过输血、静脉注射吸毒、性传播、母婴垂直传播等途径传播.近年来,吸毒人群HIV与肝炎病毒、梅毒等的重叠感染问题受到关注[1].     

软骨细胞外基质与壳聚糖复合制备组织工程软骨支架及其性能研究

 目的 探讨采用壳聚糖与脱细胞软骨基质复合制备组织工程软骨支架的可行性,检测其理化性能和细胞相容性。方法 取天然人软骨粉碎.取 100 nm~5μm 软骨微丝,脱细胞处理后制备为质量浓度 1%悬液.与质量浓度 2%壳聚糖醋酸溶液按 1颐1(重量比)充分搅拌混合,冷冻干燥制备复合支架。对支架交联,并进行组织学、扫描电镜、孔隙率及吸水性测定、生物力学评估, MTT法分析支架浸提液毒性。分离培养犬软骨细胞.种植到支架上.倒置显微镜、电镜观察细胞在支架的生长、分化情况。结果 组织学显示支架中无细胞碎片残留.II型胶原免疫组化染色阳性。扫描电镜显示支架内孔洞相互连通似海绵状.孔径为(136.2±34.9)μm.孔隙率为 81.4%±3.5%.吸水性约为 1525.7±129.3%。支架纵向弹性模量为(1.940±0.335)MPa。 MTT法显示不同浓度支架浸提液与对照培养液吸光度值比较.差异无统计学意义(P>0.05)。倒置显微镜观察.细胞在支架上粘附良好.扫描电镜下细胞在支架上均匀分布.呈圆形或椭圆形.有基质分泌。结论 软骨细胞外基质和壳聚糖复合制备的仿生三维多孔双相支架.具有较高的孔隙率和吸水性.良好的生物力学特性.无毒.生物相容性良好.是组织工程软骨的良好支架载体。     

聚碳酸亚丙酯电纺纤维的取向性对大鼠背根神经节生长的影响

目的聚碳酸亚丙酯[poly(propylene carbonate),PPC]是一种具有良好生物降解性和生物相容性的新型生物材料。探讨PPC电纺丝在周围神经组织工程应用的可行性,比较取向性和无序性PPC纤维对大鼠背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)生长的影响。方法采用电纺丝技术制备取向性和无序性PPC纤维,扫描电镜观察其表面结构特点。3只新生1～2日龄SD大鼠,雌雄不限,体重4～6 g。取SD大鼠DRG,分别接种至含取向性和无序性PPC纤维的12孔板中,作为实验组及对照组,每组6孔。倒置显微镜下观察DRG生长情况,并于培养7 d行免疫荧光染色和扫描电镜观察,定量比较神经轴突生长长度和雪旺细胞迁移距离。结果电纺丝技术成功制备取向性和无序性PPC纤维,每根纤维直径为800～1 200 nm,形成具有亚微米尺度的结构。取向性PPC纤维约90%纤维丝在其长轴方向,而无序性PPC纤维丝呈各个角度分布。倒置显微镜观察,DRG均在两组PPC纤维生长良好。免疫荧光染色和扫描电镜观察示:实验组轴突和雪旺细胞沿纤维丝方向生长,具有一致的方向性;对照组轴突生长末端呈多方向生长。实验组轴突生长长度为(2 684.7±994.8)μm,对照组为(504.7±52.8)μm,组间比较差异有统计学意义(t=—5.360,P=0.000)。实验组雪旺细胞迁移距离为(2 770.6±978.4)μm,对照组为(610.2±56.3)μm,组间比较差异有统计学意义(t=—5.400,P=0.000)。实验组及对照组内雪旺细胞迁移距离均大于轴突生长长度。结论 PPC纤维与DRG有良好亲和性,亚微米尺度PPC纤维的取向结构决定了DRG轴突和雪旺细胞生长方向,可作为周围神经损伤的修复材料。     

化学去细胞异体神经周围复合BMSCs生物蛋白胶复合物促周围神经缺损修复

目的将BMSCs复合在化学去细胞异体神经(chemical extracted acellular nerve allograft,CEANA)周围,观察对CEANA修复周围神经缺损效果的影响。方法成年雄性C57小鼠21只,体重25～30g;成年雄性Balb/c小鼠15只,体重25～30g。取Balb/c小鼠双侧坐骨神经,制备CEANA。取C57小鼠3只,分离培养BMSCs,取5×106个第3代BMSCs添加到500μL生物蛋白胶制备BMSCs生物蛋白胶复合物,共培养3、7、14、21d后,分别取其上清与PC12细胞共培养,观察对PC12细胞的影响。取成年雄性C57小鼠18只,制备小鼠左侧坐骨神经10mm缺损模型,随机分成3组(n=6),分别采用自体神经移植复合生物蛋白胶(A组)、CEANA移植复合BMSCs生物蛋白胶复合物(B组)、CEANA移植复合生物蛋白胶(C组)修复坐骨神经缺损;实验动物右侧切开暴露坐骨神经,作为正常对照。术后行大体观察;术前及术后2、4、6、8周测量小鼠坐骨神经指数(static sciatic index,SSI);术后8周取材计算术侧小腿三头肌湿重恢复率并行小腿三头肌Masson染色观察,吻合口远端神经行甲苯胺蓝染色和透射电镜观察。结果 BMSCs在生物蛋白胶内均匀分布,外观呈球形,培养3d后可见BMSCs呈多个长突起。加入BMSCs生物蛋白胶复合物共培养3、7、14、21d的上清,PC12细胞均分化为类神经元样细胞。术后各组动物切口愈合良好。各组SSI随时间延长逐渐增加,术后4、6、8周A组SSI均高于B、C组,差异有统计学意义(P<0.05);B组略高于C组,但差异无统计学意义(P>0.05)。术后8周,B组小腿三头肌湿重恢复率、有髓神经纤维总数均优于C组,但较A组差,差异有统计学意义(P<0.05);B组小腿三头肌纤维面积、髓鞘厚度均优于C组(P<0.01),而与A组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论在CEANA周围添加BMSCs生物蛋白胶复合物可提高周围神经损伤修复效果。     

双向差速法制备高纯度雪旺细胞的实验研究

[目的]利用乳鼠的雪旺细胞与成纤维细胞贴壁及复合酶消化分离速度不同的特点,建立简单而快速提取和纯化雪旺细胞的方法。[方法]取3 d SD大鼠双侧坐骨神经,在解剖镜下剥离去除神经外膜,剪碎后用0.2%复合胶原酶(Collagenase NB4)消化,细胞悬液接种于预先用多聚赖氨酸包被的培养瓶差速贴壁30 min,然后将细胞悬液移入一新的培养瓶培养48 h;用0.05%复合胶原酶37℃消化30 min,振荡分离雪旺细胞与成纤维细胞,培养48 h后在相差显微镜下观察细胞形态;计数、纯度测定;免疫细胞化学鉴定和流式细胞仪检测所得的雪旺细胞的纯度。[结果]经过2次纯化后,每25 cm2培养瓶可获取约(117.2±3.4)×104个细胞;第一轮纯化后雪旺细胞纯度达86.99%±1.53%,经2次纯化后纯度为98.32%±0.12%,两轮纯化之间有显著性差异,P<0.001;P75NTR免疫细胞化学鉴定细胞为阳性,流式细胞仪检测雪旺细胞纯度达97.9%。[结论]双向差速复合胶原酶消化法是一种高效、快捷的雪旺细胞纯化方法。