重组小鼠pcDNA3.1(+)/GDF-5真核表达质粒的构建及其意义

根据基因库中小鼠生长分化因子-5（GDF-5）序列设计并合成引物，提取孕14d小鼠胚胎肢芽组织总RNA，行RT—PCR扩增，将扩增产物GDF-5基因片断插入至pcDNA3．1（＋）载体并转化大肠杆菌DH5α，提取重组质粒，酶切鉴定及测序。结果：DNA琼脂糖凝胶电泳和双酶切均显示出一长约1603bp的带；测序结果与基因库中的序列完全相同。认为重组小鼠pcDNA3．1（＋）／GDF-5真核表达质粒构建成功，为进一步研究其在软骨发育中的作用奠定了基础。     

GDF-5在大鼠肢体早期发育中的表达规律与作用

目的 研究生长分化因子-5（GDF-5）在大鼠肢体早期发育过程中的表达规律，探讨GDF-5调控肢体发育的相关机制。方法 采用半定量RT-PCR和Westernblotting分别检测GDF-5在大鼠胚胎早期发育过程中肢芽组织mRNA和蛋白表达的变化。结果 大鼠胚胎肢体发育的早期阶段GDF-5mRNA呈持续表达，其中在胚胎13、14d（E13、E14）呈高表达，继而表达减弱，GDF-5蛋白表达规律与mRNA变化趋势一致。结论 GDF-5在大鼠胚胎早期肢体发育中对调控软骨发育和关节形成有很重要的作用。     

全踝关节置换术治疗继发性踝关节炎的中期随访及疗效分析

目的评估全踝关节置换术（total ankle replacement,TAR）治疗继发性踝关节炎的治疗效果。方法回顾性分析1999年5月至2006年5月行TAR的18例患者,男2例,女16例;年龄52～66岁,平均61岁;病程9个月－18年。其中骨关节炎5例,创伤性关节炎9例,类风湿关节炎4例。患者均经保守治疗无效,且踝关节疼痛,活动障碍。术后患者定期随访,进行临床和影像学评估。结果患者均获随访,随访时间2～9年,平均5．4年;其中16例获得满意疗效。依据美国矫形足踝协会（American orthopaedic foot and ankle society,AOFAS）评分标准评分,由术前的27～53分,平均（41．5±6．8）分,提高至术后的60—91分,平均（74．6±9．7）分,视觉模拟评分（visual analogue scale,VAS）由术前的5～10分,平均（8．4±2．1）分改善至术后的1～4分,平均（2．3±0．9）分。无一例患者需行踝关节融合术或踩关节翻修术。影像学评估,16例假体位置稳定、无下沉迹象,2例在胫骨假体和骨质接触发生气球样骨溶解,但无任何症状。结论TAR可用于治疗踝关节炎。尽管TAR的中期随访效果比较满意,但TAR仍属较新技术,其远期临床效果有待进一步随访评估。     

无瘤护理在恶性肿瘤手术中的应用

目前恶性肿瘤发病率越来越高,外科手术仍是目前治疗恶性肿瘤首选的方法。其中无瘤操作技术的重要性逐渐得到体现,它可以减少或防止手术操作中癌细胞的脱落、种植和播散,有效减少根治性手术后肿瘤的局部复发和远处转移,从而改善患者的预后,延长生存期,而无瘤护理是施行根治性手术时不容忽视的重要环节。近10年,我院在实施无瘤操作技术以来,取得了显著效果。现将近些年来进行“元瘤护理”的经验总结如下。     

骨肉瘤反义核酸基因治疗研究进展

上世纪90年代兴起的利用反义核酸对肿瘤进行基因治疗的新技术给骨肿瘤患者带来了新的希望。本文对骨肉瘤反义基因治疗的应用策略进行了较为详尽的阐述,并提出今后该领域发展的方向和前景。     

生长分化生长因子-5在诱导小鼠骨髓间充质干细胞软骨分化中的作用

生妊分化生长因子5（GDF-5）是调控肢体骨骼发育和关节形成的一个重要因子，参与细胞聚集和软骨分化等过程的调节。笔者采用重组GDF-5直接干预小鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）．观察其对细胞增殖和软骨分化的影响，为进一步探讨其在软骨发育的作用机制提供实验依据。     

骨形态发生蛋白-2基因活化纳米骨浆修复兔桡骨缺损的实验研究

目的观察骨形态发生蛋白-2（BMP-2）基因活化纳米骨浆在损伤部位的局部成骨基因表达和骨缺损重建修复效果。方法新西兰白兔54只，其中48只实验动物随机分成三组（每组16只32侧），制成双侧桡骨中段15mm骨缺损模型。A组：注入hBMP-2＋纳米骨浆；B组：注入空白质粒＋纳米骨浆；C组：注入纳米骨浆。另6只动物制作左桡骨中段骨缺损，不植入材料，作为空白对照。术后4、8和12周取材行影像学检查、组织学观察、分子生物学检测和生物力学检测。结果术后12周A、B和C组骨缺损均修复，A组骨缺损处有明显BMP-2的mRNA和蛋白质表达，在ALP水平、成骨速度、新生骨量及新生骨力学强度等方面均明显优于B、C两组（P〈0．05）。空白对照组骨缺损无愈合。结论纳米骨浆复合BMP-2质粒后，具有一定骨诱导作用，植入体内后成骨速度、质量及力学强度较单纯的纳米骨浆明显增强，能够有效修复骨缺损。     

陈旧性胸腰椎骨折伴后凸畸形的截骨矫形术式选择

目的:观测经椎弓根截骨(PSO)与Smith-Petersen截骨(SPO)两种术式治疗胸腰椎陈旧骨折伴后凸畸形的矫形效果和临床疗效,探讨截骨矫形术式选择。方法:2006年3月~2014年12月,对47例创伤性后凸畸形患者进行了截骨矫形手术。其中男30例,女17,年龄22~69岁,平均42.5±15.5岁。均为陈旧性胸腰椎骨折导致的创伤性后凸畸形。47例患者主诉均为腰背部疼痛。针对不同病理特征和畸形程度,32例行PSO矫形,15例行SPO矫形。PSO手术在病椎行经椎弓根楔形截骨矫形,SPO手术在病椎上下及相邻间隙做2~3节段SPO截骨矫形。通过术前、术后和末次随访全脊柱正侧位X线片,测量后凸畸形Cobb角及矢状面平衡(SVA),分析两种方法矫形效果,采用疼痛视觉模拟评分(VAS)评估疼痛情况,应用Oswestry功能障碍指数(ODI)分析两种方法临床疗效。结果:47例中有42例获得随访,其中PSO手术29例,SPO手术13例。随访时间8~48个月,平均29.4±7.8个月。42例均获得骨性融合。后凸畸形Cobb角PSO组术前为41.8°±10.5°,术后为2.6°±1.2°,末次随访时为3.2°±1.3°,矫正率92.3%;SPO组术前为40.2°±9.6°,术后为4.9°±2.3°,末次随访时为5.3°±3.5°,矫正率86.8%。两组术后、末次随访时Cobb角与术前相比均有显著性差异(P0.05)。PSO组SVA术前为5.0±4.1cm,术后为-0.6±2.2cm,末次随访时为1.2±1.5cm;SPO组SVA术前为3.5±2.2cm,术后为0.8±0.6㎝,末次随访时为1.3±1.1cm。两组术后、末次随访时SVA与术前相比均有显著性差异(P0.05)。PSO组VAS术前为6.46±1.72,末次随访时为0.91±0.59,ODI术前为(69.4±12.1)%,末次随访时为(23.7±11.5)%;SPO组VAS术前为6.51±1.87,末次随访时为2.08±0.75,ODI术前为(68.1±16.3)%,末次随访时为(33.1±12.5)%,两组随访VAS和ODI与术前相比有显著性差异(P0.05)。结论:针对不同病理特征和畸形程度的胸腰椎陈旧骨折伴后凸畸形患者,选用PSO或SPO矫治均可取得良好矫形效果及临床疗效。     

pcDNA3.1(+)/GDF-5真核表达质粒的构建及其在小鼠骨髓基质干细胞的表达

目的:通过基因重组技术体外构建真核表达质粒pcDNA3．1( )／GDF-5,并检测其在小鼠骨髓基质干细胞中的表达。方法:提取孕14 d小鼠胚胎肢芽组织总RNA,RT-PCR扩增,将扩增产物GDF-5基因片断插入至pcDNA 3．1( )载体,并进行酶切鉴定及测序;脂质体介导pcDNA 3．1( )／GDF-5重组质粒瞬时转染小鼠MSC,RT-PCR和免疫细胞化学检测GDF-5的表达。结果:重组质粒双酶切图谱显示有5．4 kbp和1．6 kbp两条带;测序结果与Genbank中的序列完全相同;转染后RT- PCR显示实验组有一219bp特异性条带,免疫细胞化学检测发现实验组细胞胞浆内有棕色阳性染色,实验对照组和空白组均为阴性。结论:本实验成功构建pcDNA3．1( )／GDF-5真核表达质粒,转染小鼠MSC中有GDF-5表达,为进一步研究其在软骨发育机制和软骨骨组织工程领域提供了实验基础。     

生长分化因子5真核表达质粒转染小鼠骨髓基质干细胞体外诱导向软骨细胞分化

背景：生长分化因子5是软骨与骨组织形成、发育的重要调解因子,在诱导软骨形成,促进骨、软骨、肌健韧带损伤修复方面发挥重要作用。 目的：小鼠骨髓基质干细胞体外转染真核表达质粒pcDNA 3.1(+)/生长分化因子5,检测与软骨形成分化相关的细胞外基质及蛋白多糖的表达。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2008-03/12在武汉协和医院中心实验室完成。 材料：雄性昆明种小鼠20只,由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。生长分化因子5真核表达质粒pcDNA 3.1(+)/生长分化因子5为自备。 方法：全骨髓贴壁法体外分离培养小鼠骨髓基质干细胞,取传至第3代细胞接种到6孔板,在细胞生长到90%融合时开始转染。设立3组：转染组采用LipofectamineTM2000进行脂质体介导pcDNA3.1(+)/生长分化因子5重组质粒瞬时转染;空质粒组转染空质粒pcDNA 3.1(+);空白对照组只加入等量脂质体,其余步骤相同。 主要观察指标：转染后72 h通过RT-PCR及免疫细胞化学检测生长分化因子5基因与蛋白的表达鉴定转染是否成功,同法检测软骨基质Ⅱ型胶原的表达,转染后14 d阿尔辛蓝染色检测蛋白聚糖的表达。 结果：转染组有一大小为219 bp的特异性扩增条带,骨髓基质干细胞胞浆内呈棕色阳性染色;而空质粒组、空白对照组均未发生生长分化因子5基因转录,无特异性扩增条带,且细胞胞浆未见明显染色。转染组可检测到Ⅱ型胶原基因的表达,基因大小225 bp,Ⅱ型胶原细胞胞浆中可见棕黄色染色;空质粒组、空白对照组均未检测到Ⅱ型胶原基因的表达,SP染色均无明显染色。阿尔辛蓝染色后转染组细胞呈蓝染,空质粒组、空白对照组均未见明显异染性着色。 结论：pcDNA3.1(+)/生长分化因子5转染骨髓基质干细胞能显著增加Ⅱ型胶原及蛋白聚糖的表达,促进骨髓基质干细胞向软骨细胞方向分化。