椎间盘退变时水通道蛋白1表达变化研究

目的阐明水通道蛋白1在椎间盘退变时表达变化特点。方法采用腰椎失稳的方法建立大鼠腰椎间盘退变的动物模型,影像学观察模型建立的可靠性,收集大鼠椎间盘组织,部分用于提取RNA,采用RT-PCR的方法检测水通道蛋白1mRNA表达的变化,部分标本用western blot进行AQP1蛋白的检测。结果腰椎失稳可以建立大鼠腰椎间盘退变模型,AQP1mRNA的表达随椎间盘退变的进程进行性下降,其蛋白表达也呈现进行性下降的趋势,术后3月时同术前相比相差显著(P<0.05),术后6月和9月则下降更为明显(P<0.01);而在手术对照组而言,于术后6月时也出现AQP1基因和蛋白表达水平的下降(P<0.05)。结论腰椎间盘退变时,AQP1在基因和蛋白的表达水平下降,且与退变的时间长短相关,提示AQP1参予了椎间盘退变的发生发展,AQP1表达的下降可能是引起椎间盘退变的原因之一。     

应用RNA干扰技术抑制神经元E3B1基因表达及对轴突生长的影响

目的:探讨应用RNA干扰(RNAi)技术抑制神经元E3B1基因表达及其对轴突生长的影响.方法:选择针对E381(NCBI:NM-024397)RNAi的3个靶位点Abil1、Abil2、Abil3和1个不针对任何mRNA的RNAi靶位点(阴性对照)以及甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH,阳性对照),用带有neoR选择标志和GFP绿色荧光标志的真核表达载体pGenesil-1构建E381 RNAi质粒,分别转染培养的神经元,在荧光显微镜下观测转染率,经G418筛选得到单一的转染细胞,并用Western blot法检测各转染组神经元E3B1蛋白的表达情况,选出具有最佳抑制效应的siRNA转染神经元,加人轴突生长抑制物,观测轴突生长情况.结果:成功构建了RNAi质粒,各组细胞的转染率相近,均为34%左右.与阴性对照组相比,Abil1、Abil2和Abil3转染组细胞内E3B1 mRNA的表达都受到了不同程度的抑制,其中Abil3转染组细胞的E381 mRNA和蛋白的表达抑制最为显著,加入轴突抑制剂后Abil3转染组神经元轴突仍能继续生长.结论:应用RNA干扰技术能高效特异地抑制神经元E3B1基因的表达,E3B1基因的表达下调可促进神经元轴突的生长.     

心肌营养素1/破伤风毒素重链C端片段融合蛋白的构建及其靶向大鼠嗜铬细胞瘤细胞的研究

目的：探讨心肌营养素1（cardiotrophin 1，CT1）/破伤风毒素重链C端片段（tentanus toxin C fragment,TTC）（CT1/TTC）融合蛋白的构建及其对大鼠嗜铬细胞瘤（pheochromocytoma,PC12）细胞的靶向性。方法：采用聚合酶链式反应（PCR）、T-A克隆等分子生物学方法构建CT1/TTC融合蛋白。体外培养PC12细胞,并将CT1/TTC融合蛋白与PC12细胞共培养,红色荧光免疫组化染色后在激光共聚焦显微镜下观察融合蛋白能否在TTC的靶向作用下进入PC12细胞。结果：成功构建了CT1/TTC融合蛋白,测序显示融合基因序列正确,免疫组化染色结果显示融合蛋白能够进入PC12细胞，并发出红色荧光。结论：采用PCR和T-A克隆等分子生物学方法能成功构建CT1/TTC融合蛋白．并且TTC能够将CT1靶向进入PC12细胞。     

成骨细胞特异性钙黏蛋白涂布脱钙骨基质材料对BMSCs黏附及成骨分化能力的影响

目的 探讨成骨细胞特异性钙黏蛋白(cadhefin ectodomain Ⅱ,Cad-Ⅱ)涂布于同种异体脱钙骨基质材料(freeze-dried demineralized bone matrix,FDBM)对兔BMSCs黏附、增殖及成骨分化能力的影响.方法 取4周龄日本大耳白兔10只,体重0.61～0.88 kg,雌雄不限,常规分离培养BMSCs.取第2代BMSCs(细胞密度1×106个/mL)分别与经Cad-Ⅱ修饰的FDBM(实验组)和未经Cad-Ⅱ修饰的FDBM(对照组)复合,行MTT检测细胞增殖能力,细胞黏附实验检测细胞上架率和上架数,倒置相差显微镜、扫描电镜及HE染色观察细胞生长情况.另取第2代BMSCs(细胞密度5×105个/mL)分别与经Cad-Ⅱ修饰的FDBM(实验组)和未经Cad-Ⅱ修饰的FDBM(对照组)复合培养,行ALP活性检测和骨钙素免疫组织化学染色观察细胞成骨分化情况.结果 MTT检测发现BMSCs在经Cad-Ⅱ修饰的支架材料上能正常增殖,但与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05).实验组细胞上架率为87.41%±5.19%,明显高于对照组35.56%±0.75%(P<0.01);对照组每片材料细胞上架数平均为2.6×104个,实验组平均高达5.0×105个,明显多于对照组(P<0.05).倒置相差显微镜、扫描电镜及HE染色观察均显示实验组支架上黏附细胞数量明显多于对照组.成骨诱导培养7 d,实验组和对照组细胞均可表达骨钙素,具有成骨细胞表型;培养14 d,实验组和对照组ALP活性分别为29.33±1.53和18.31±1.32,骨钙素免疫组织化学染色阳性率分别为83%±7%和56%±7%,两组比较差异均有统计学意义(P<0.01);与同组7、21 d比较差异有统计学意义(P<0.01),7 d与21 d组间及组内比较差异均无统计学意义(P>0.05).结论 Cad-Ⅱ修饰的FDBM对BMSCs增殖无明显促进作用,但能提高细胞黏附性,并促进BMSCs向成骨细胞分化.     

经皮内镜椎间盘切除术治疗慢性椎间盘源性腰痛的初步研究

目的 评价经皮内镜腰椎间盘切除术(percutaneous endoscopic lumbar discectomy,PELD)治疗经保守治疗无效的慢性椎间盘源性腰痛的初步临床效果. 方法 2007年6月-2008年5月,收治52例经保守治疗无效的慢性腰痛患者,经低压椎间盘造影诊断为椎间盘源性疼痛.其中男15例,女37例;年龄29～46岁,平均38.2岁.慢性腰痛病程6～110个月,平均32.1个月.经MRI检查显示共有108个T2像低信号的"黑椎间盘",按信号异常椎间盘节段分布:L2、3 3个,L3、417个,L4、548个,L5～S140个.经造影显示为阳性,并行透视或术中CT证实椎间盘后方纤维环撕裂的有79个椎间盘,行PELD治疗.于术前、术后1个月及末次随访时行疼痛视觉模拟评分(visual analogue scale,VAS),末次随访时按改良Macnab标准评价1临床疗效. 结果 每节段手术时间21～36 min,平均30.7 min;术后住院时间2～5 d,平均3.7 d.术后无感染、血管神经损伤等并发症发生;5例术后当天出现一过性神经麻痹,未行特殊处理,末次随访时症状消失.52例均获随访,随访时间3～15个月,平均7.3个月.腰痛VAS评分术前为(7.34±1.52)分,术后1个月及末次随访时分别为(3.62±0.92)分和(1.57±0.48)分,与术前比较差异均有统计学意义(P<0.01).根据改良Macnab标准,优11例,良23例,可13例,差5例,优良率65.38%. 结论 初步研究提示PELD安全有效,可用于治疗经保守治疗无效的慢性椎间盘源性腰痛患者.     

脱矿脱细胞骨基质环支架体外构建组织工程化椎间盘纤维环

目的:探计以脱矿脱细胞骨基质环为支架、纤维环细胞为种子细胞体外培养构建组织工程化椎间盘纤维环的可行性.方法:取兔椎间盘纤维环细胞培养,应用甲苯胺蓝染色和Ⅰ型、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色进行鉴定.用纤维蛋白凝胶接种技术将兔椎间盘纤维环细胞接种到经脱矿脱细胞制备的骨基质环支架材料上,体外培养3个月.每月取培养的细胞支架复合体进行大体形态、HE染色光镜检查和扫描电镜观察,并用生化方法榆测羟脯氨酸、氨基葡聚糖(GAG)、脱氧核糖核酸(DNA)含量;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测Ⅰ、Ⅱ型胶原信使核糖核酸(mRNA)表达;免疫组化和蛋白质印迹方法检测Ⅰ、Ⅱ犁胶原蛋白表达.结果:培养的第1代细胞甲苯胺蓝染色呈异染性,Ⅰ型、Ⅱ型胶原免疫组化染色均可见阳性表达,表明培养的第1代细胞具有椎间盘纤维环细胞的表型特点.构建的复合体体外培养1、2、3个月时大体呈白色半透明样环状,有光泽,质韧,具有一定弹性,可扭曲;HE染色光镜下见支架孔洞被红染的组织填充,且空洞内的细胞密度逐渐增加;扫描电镜观察材料表面逐渐被组织填充;Ⅰ型、Ⅱ型胶原免疫组化染色均为阳性;培养2个月时复合体羟脯氨酸、GAG、DNA含量明显高于1个月时(P<0.01),3个月时与2个月时比较无显著性差异(P>0.05).各时间点复合体羟脯氨酸、GAG、DNA含量均低于正常纤维环(P<0.05或<0.01);培养1个月时复合体可检测到Ⅰ、Ⅱ型胶原mRNA和蛋白的表达.2个月时与1个月时比较有显著性差异(P<0.01),3个月时与2个月时比较无显著性差异(P>0.05).结论:以脱矿脱细胞骨基质环为支架、纤维环细胞为种子细胞构建的复合体在体外培养时,细胞能够保持表型特点、逐渐增殖和行使功能,此复合体可被鉴定为类纤维环组织,用其构建组织工程化椎间盘纤维环可行.     

腰椎滑脱伴邻近节段退变的诊疗分析

[目的]探讨腰椎滑脱伴邻近节段退变诊断、治疗效果及其临床意义.[方法]自2000年10月～2005年10月,对16例腰椎滑脱伴邻近节段退变患者行切开复位内固定术,采用Prolo腰椎功能评定评估腰椎术后功能,影像学评估椎体滑脱复位程度、椎间隙高度、固定节段前凸的恢复、融合器位置、植骨融合情况及内固定物有无松动等,对X线片结果可疑病例,追加CT检查.[结果]本组14病例获得随访,平均随访时间28个月(16～53个月);术后3个月Prolo评分结果:7分3例,8分7例,9分2例,4分2例,优良率为85.7%;末次Prolo评分结果:7分4例,8分6例,9分4例,优良率为100%;术后6个月有8例达到骨融合标准,占66.7%,术后12个月有13例达到骨性融合标准,占92.9%;1例椎间融合可疑,患者没有临床症状和体征.术后1周复查X线片显示:完全复位10例,占71.4%,4例复位>50%,术后12个月及术次随访复查没有出现复位丢失.术前、术后3个月及末次随访腰椎前凸角分别为26.64°、33.29°、32.36°;术前、术后6个月及末次随访固定节段前凸角分别为15.64°、28.29°、32.36°;椎间隙高度术前、术后分别为6.54 mm、9.62 mm,术前与术后相比有统计学意义(P<0.05).所有患者没有出现伤口感染、神经损伤等并发症,无内固定物断裂、松动;没有出现椎间融合器位置不良、塌陷、移位等并发症.[结论]腰椎滑脱伴邻近节段退变发病率和治疗具有自身的临床特点;采用双节段或三节段固定、融合近、中期临床效果优良,是一种有效、安全的方法.     

破伤风毒素C端片段与心肌营养素-1融合蛋白表达、纯化与靶向神经元逆向运输及神经营养活性鉴定

目的 在BL21(DE3)大肠杆菌中表达破伤风毒素C端片段(TTC)与心肌营养素(CT)-1融合蛋白并纯化.探讨TTC转导结构域对CT-1的靶向神经元逆向运输活性与CT-1的神经营养活性.方法 异丙基-B-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导BL21(DE3)大肠杆菌表达CT-1/TTC融合蛋白,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)与WB法鉴定融合蛋白表达.制备SD大鼠坐骨神经损伤模型,分别经神经再生室、肌肉注射给药,自由放养1周后处死,4%多聚甲醛灌注固定,取脊髓L4～L6腰膨大标本,冰冻切片,免疫组织化学检测.制备新生6～7 d龄sD大鼠坐骨神经损伤模型,肌肉注射CT-1/TTC融合蛋白,自由放养1周后处死,4%多聚甲醛灌注固定,取L4～L6腰膨大标本,冰冻切片,尼氏染色计数脊髓前角运动神经元.结果 原核表达目的 蛋白CT-1/TTC表达量占全菌蛋白总量的15%,以可溶性蛋白为主.通过谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签亲和纯化获得2.7 g/L的CT-1/TTC重组融合蛋白.免疫组织化学于脊髓腰膨大检测到CT-1/TTC融合蛋白.坐骨神经损伤后,脊髓L4～L6腰膨大前角运动神经元计数较CT-1/TTC融合蛋白处理组减少,存活率下降.结论 基因重组CT-1/TTC蛋白在大肠杆菌中获得了表达和纯化,所获得的融合蛋白有靶向性脊髓神经元细胞的活性和对损伤后运动神经元的神经营养活性.     

CTA在颅内破裂动脉瘤早期诊治中的作用

颅内动脉瘤（intracranial aneurysm）系颅内动脉壁的囊性膨出,是引起自发性蛛网膜下腔出血的首位病因,本病好发于40～60岁中老年人,青少年少见。随着现代医学检查设备的迅猛发展,颅内动脉瘤在人群中的检出率逐渐提高。早期发现和消除颅内动脉瘤是提高白发性蛛网膜下腔出血患者生存率的重要手段。     

脱矿脱细胞骨基质环细胞支架的物理化学性能研究

目的 探讨脱矿脱细胞骨基质环物理化学性能是否适合用于构建组织工程椎间盘纤维环细胞支架.方法 取兔股骨近端骨制成环状,经脱矿脱细胞处理并对材料的外形、组织结构、孔隙率、吸水力、平均孔径、体外生物降解性能等支架性能指标进行检测.结果 该材料为环状,质地柔韧,多孔结构;HE染色光镜观察显示支架材料为嗜酸性,为不均匀的多孔结构:扫描电镜观察发现支架材料为相互沟通的多孔结构,支架材料的平均孔径为(246±113)μm.平均孔隙率为(77.8±2.8)%.吸水力平均为(72.5±5.9)%.支架材料与松质骨体外生物降解率无明显差异(P>0.05).支架材料最大载荷为(0.61±0.28)N,与正常椎间盘比较P<0.05,有显著差异.可拉伸长度为(17.2±2.3)%,与正常椎间盘纤维环比较P>0.05,差异不显著.结论 脱矿脱细胞骨基质环的物理化学性能适合作为组织工程椎间盘纤维环细胞支架材料.