加强肝纤维化的诊断与治疗研究

一、肝纤维化的诊断问题 1.肝脏瞬时弹性硬度值测定、磁共振弹性成像、超声造影技术的应用研究:(1)肝脏瞬时弹性硬度测定值[肝脏硬度测定(liver stiffness measurement,LSM)或FibroScan (FS)]和肝组织纤维化程度的Metivia分期相关,该方法测量的深度可达2cm,测量表面的直径大约为1cm(即测量的范围约为1.57cm3),约为肝活组织检查的500倍.FS的测量深度可达4cm(约3.14cm3),约为整个肝脏的1/500.Foucher等[1]认为惟一影响FS成功率的因素是人体质量指数＞28.     

以线粒体为靶点筛选中药抗肝毒性的活性成分研究思路与方法

肝脏是药物代谢的主要场所,肝细胞线粒体是药物肝损伤的重要靶标,线粒体自噬可以维持细胞内线粒体的健康运转以及细胞的稳定增殖,因此利用线粒体自噬来清除受损线粒体是抗药物性肝损伤的重要策略。多种中药中含有可以增强线粒体自噬的活性成分,可以调节线粒体自噬从而缓解相关疾病。但如何准确高效地从中药中发现并评价此类对线粒体有靶向活性成分的研究方法鲜有报道。而采用液质联用技术,以体内过程结合血清药理学的方法能准确、高效地锁定作用于线粒体靶点的中药活性成分。该文综述了增加线粒体自噬解药物肝毒性的中药成分研究思路与方法,为以线粒体为靶点的中药活性成分研究提供新思路与方法。     

1例不明原因的肝硬化诊治

布加综合征是由各种原因引起的肝静脉流出道梗阻，导致以肝充血和门静脉高压为特征的综合征。典型肝脏病理特征为肝窦明显扩张，慢性发展可出现肝硬化。临床诊断通常依赖影像学检查提示，并通过金标准下腔静脉造影确诊。但因该病临床表现复杂多变，容易误诊漏诊，延误治疗。现报道1例先因误诊漏诊而治疗无效的布加综合征引起的肝硬化病例，最终基于肝活检病理检查发现、门静脉CT检查和下腔静脉造影得以临床确诊与有效治疗的过程，以期提高对该病的认识。     

胆淤方对胆汁淤积小鼠胆汁酸代谢的影响

目的 探讨胆淤方对1,4-二氢-2,4,6-三甲基-3,5-吡啶二甲酸二乙酯（DDC）诱导胆汁淤积小鼠血清胆汁酸代谢的影响。方法 40只雄性C57BL/6J小鼠随机分为4组：对照（N）组、DDC模型（M）组、奥贝胆酸（O）组、胆淤方（D）组,每组10只。N组小鼠用普通饲料喂养,M、O和D组小鼠用DDC饲料喂养,连续6周。造模第3周开始药物干预,O组ig予奥贝胆酸溶液（0.03 g·kg^-1）,D组ig予胆淤方药液（33 g·kg^-1）,M组和N组予相同体积的双蒸水。干预4周,收集小鼠血清和肝组织,试剂盒检测血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、总胆红素（TBIL）和总胆汁酸（TBA）水平,HE染色观察肝组织炎症反应,CK19染色观察细胆管增生反应,天狼腥红染色观察纤维化,采用液质联用技术检测血清胆汁酸谱。结果 O组和D组ALT、AST、ALP、TBA、TBIL水平均较M组显著下降（P＜0.05）;D组ALT、AST水平较O组显著下降（P＜0.05）。D组小鼠肝组织炎症反应、纤维化及细胆管增生较M组减轻。D组血清初级胆汁酸胆酸（CA）和ω-鼠胆酸（ω-MCA）水平均较M组显著下降（P＜0.001）;D组血清次级胆汁酸甘氨胆酸（GCA）、牛磺胆酸（TCA）、牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）、牛磺鹅去氧胆酸（TCDCA）、牛磺去氧胆酸（TDCA）、牛磺猪去氧胆酸（THDCA）较M组显著下降（P＜0.05、0.01、0.001）,O组的CA、ω-MCA、TCDCA、GCA和TCA水平较M组显著下降（P＜0.001）,D组血清TUDCA水平较O组下降更加显著（P＜0.05）。热图分析显示13种胆汁酸可将M与N组、O与M组、D与M组、D与O组血清胆汁酸谱两两区分。结论 胆淤方可改善肝内炎症反应,具有广泛的降胆汁酸作用。     

扶正化瘀方影响转化生长因子β1/Smad信号通路的抗肝纤维化作用机制

目的：探讨扶正化瘀方影响转化生长因子β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）/Smad信号转导的抗肝纤维化作用机制。方法：本研究分体内实验和体外实验两部分。在体内实验中,37只雄性Wistar大鼠分为正常组（5只）、模型组（18只）和扶正化瘀方组（14只）。模型组和扶正化瘀组大鼠采用二甲基亚硝胺（dimethylnitrosamine,DMN）腹腔注射复制大鼠肝纤维化模型。灌胃治疗4周后,采用盐酸水解法检测肝组织中羟脯氨酸（hydroxyproline,Hyp）含量,蛋白质印迹法分析肝组织中TGF-β1、TGF-β1Ⅰ型受体（TGF-β1 type Ⅰ receptor,TβR-Ⅰ）、Smad2、Smad3及磷酸化Smad2/3蛋白的表达。体外实验采用培养4d的原代大鼠肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSC）,分为对照组、TGF-β1组、10%扶正化瘀方药物血清组及TβR-Ⅰ胞内激酶抑制剂（SB-431542）组。后3组用2.5ng/mLTGF-β1刺激24h后,对照组及TGF-β1组加10%正常大鼠血清,10%扶正化瘀方药物血清组加10%服用扶正化瘀方的大鼠血清,SB-431542组加10%正常大鼠血清及10μmol/LSB-431542。共孵育24h后,免疫荧光染色检测HSC中α平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）和Smad3蛋白的表达,蛋白质印迹法分析HSC中α-SMA蛋白的表达。结果：体内实验发现,扶正化瘀方可明显降低纤维化肝组织中异常升高的Hyp含量及TGF-β1、TβR-Ⅰ、磷酸化Smad2/3蛋白的表达。体外研究发现,正常HSC中α-SMA、TβR-Ⅰ表达较低,TGF-β1刺激可显著上调其表达;扶正化瘀方药物血清共孵育后,可明显抑制TGF-β1诱导的HSC中α-SMA的表达;正常HSCSmad3主要表达在细胞质中,细胞核中表达较低,TGF-β1可显著刺激Smad3向细胞核转移,扶正化瘀方药物血清可明显抑制TGF-β1诱导的Smad3核转位。结论：扶正化瘀方可下调纤维化大鼠肝脏及HSC中的TGF-β1/Smad病理信号转导通路,这可能是扶正化瘀方抗肝纤维化的部分作用机制。     

不同剂量虫草对肝纤维化小鼠肝脏TGF-β1、Smad3的影响

目的明确不同剂量冬虫夏草对四氯化碳小鼠肝纤维化的作用及对TGF-β1mRNA、Smad3蛋白表达的影响。方法四氯化碳(CCl4)皮下注射复制BALB/c小鼠肝纤维化模型,虫草组在造模同时予以不同剂量虫草煎剂,直至造模结束。HE染色观察肝组织炎症,天狼猩红染色观察肝脏胶原沉积,生化法测定肝组织羟脯氨酸(Hyp)含量,免疫组化测定Smad3在肝脏内的表达,RT-PCR测定TGF-β1mRNA在肝脏内的表达。结果与正常小鼠比较,肝纤维化小鼠肝脏肝静脉与汇管区周围肝细胞明显脂肪变性,肝脏胶原沉积,可见纤维间隔形成,肝脏Hyp含量、TGF-β1mRNA、Smad3蛋白表达量均显著增加。与模型组比较,虫草组肝脏炎症与胶原沉积减轻,TGF-β1mRNA、Smad3蛋白表达量明显降低,以虫草高剂量组为明显。结论肝纤维化BALB/c小鼠的肝脏TGF-β1mRNA、Smad3蛋白表达明显上升,虫草制剂有良好的抗肝纤维化作用,高剂量虫草有着更好的抗肝纤维化作用,其作用机制与下调Smad3蛋白及TGF-β1mRNA表达有关。     

HPLC-MSn分析扶正化瘀方中五味子的入血成分

目的:分析扶正化瘀方(Fuzheng Huayu decoction,FZHY)灌胃大鼠后进入血液的五味子中木脂素类成分,以探讨部分体内效应成分.方法:应用液相色谱-电喷雾质谱联用(HPLC-ESI-MSn)技术,通过空白血清,口服FZHY方后含药血清,FZHY方和对照品之间的色谱图和质谱碎片信息的对比分析,结合文献报道,确定口服FZHY方后大鼠的入血成分.结果:FZHY方和口服FZHY方后含药血清中均含有五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子乙素,并在FZHY方中还发现含有五味子甲素和丙素.结论:五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子乙素是直接吸收入血的成分,可能是发挥抗肝纤维化的体内效应成分.     

冬虫夏草对肝纤维化小鼠Smad3蛋白表达的影响

目的探讨冬虫夏草对四氯化碳致小鼠肝纤维化的作用及肝脏Smad3蛋白表达的影响。方法四氯化碳皮下注射复制BALB/c小鼠肝纤维化模型,虫草组在造模同时予以虫草煎剂,直至造模结束。HE染色观察肝组织炎症,天狼猩红染色观察肝脏胶原沉积,生化法测定肝组织羟脯氨酸（Hyp）含量,免疫组化测定Smad3在肝脏内的表达。结果与正常小鼠比较,肝纤维化小鼠肝脏肝静脉与汇管区周围肝细胞明显脂肪变性,肝脏胶原沉积,可见纤维间隔形成,肝脏Hyp含量、Smad3蛋白表达量均显著增加。与模型组比较,虫草组肝脏炎症与胶原沉积减轻,Smad3蛋白表达量明显降低。结论肝纤维化BALB/c小鼠的肝脏Smad3蛋白表达明显上升,虫草制剂有良好的抗肝纤维化作用,其作用机制与下调Smad3蛋白表达有关。     

二甲基亚硝胺致大鼠脂质过氧化变化与药物干预作用

目的探讨二甲基亚硝胺（ＤＭＮ）诱导大鼠肝纤维化的脂质过氧化病理机制,以及扶正化瘀方与干扰素Ｖ的干预作用。方法ＤＭＮ复制大鼠肝纤维化模型,分别以扶正化瘀方灌胃及（干扰素肌注治疗。观察项目包括肝脏病理、肝功能、肝组织羟脯氨酸（Ｈｙｐ）、丙二醛（ＭＤＡ）含量与超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）活性。并进行Ｈｙｐ、ＭＤＡ与ＳＯＤ之间的相关分析。结果模型大鼠肝组织胶原明显增生,纤维间隔形成; ＡＬＴ水平上升;肝组织Ｈｙｐ与ＭＤＡ含量显著增加, ＳＯＤ活性显著降低,且ＳＯＤ与 ＭＤＡ、 Ｈｙｐ呈负相关（ｒ＝０．７０,－０．７３,Ｐ＜ ０．０１）,ＭＤＡ与 Ｈｙｐ呈正相关（Ｔ＝０．８８, Ｐ＜ ０．０１）。扶正化瘀方与干扰素γ均能明显减轻肝组织胶原沉积、降低ＡＬＴ水平,提高肝组织ＳＯＤ活性、降低肝组织Ｈｙｐ与ＭＤＡ含量。结论脂质过氧化是ＤＭＮ损伤大鼠并诱发肝纤维 化的主要机制之一,抗脂质过氧化是扶正化瘀方与干扰素γ抗肝纤维化的重要作用机理。     

DMN诱发鼠肝纤维化过程中肝门静脉压力的变化

本文通过模型大鼠门脉压力的测定 ,观察二甲基亚硝胺(ＤＭＮ )诱发大鼠肝硬化过程中门脉压力的动态变化以及与肝纤维化关系。材料与方法一、材料Ｗｉｓｔａｒ雄性大鼠 ,体重 14 0～ 15 0 ｇ ,购自中科院上海实验动物中心。ＤＭＮ购自瑞典威灵公司。ＰＴ14ＭＸ 4ｋＰａ生理压力传感器购自复旦大学传感器工程研究室。二、模型制备将 0 .5 %ＤＭＮ溶液按 0 .2ｍｌ/10 0 ｇ体重剂量予大鼠腹腔注射 ,每周连续注射 3ｄ ,共 4周 ,第 1周用 2 /3量 ,以后用全量。共设 10个观察组 ,分别是 2ｄ ,1、2、3、4、5、6、8、12和 2 4周。每组设正常对照鼠 3…