丙型肝炎病毒F蛋白反式激活基因2的克隆化研究

目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioinformatics)技术筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)F蛋白反式激活新型靶基因,进一步阐明HCV感染相关疾病的发病机制.方法:以HCV F蛋白表达质粒pcDNA3.1(-)-F转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析.应用分子生物学技术,结合生物信息学技术,克隆HCV F蛋白反式激活作用的新的靶基因.结果:对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段.从HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实,因其可以被F蛋白反式激活,故命名为F蛋白反式激活蛋白2(HCV FTP2),已在GenBank中注册,注册号:AY740522.HCV FTP2基因的编码序列全长为177个核苷酸(nt),编码产物由58个氨基酸残基(aa)组成.结论:HCV F蛋白在病毒的自然感染过程中有明显的表达,最近的研究表明蛋白还具有反式激活的作用,上调宿主细胞某些基因的表达,可能参与HCV致癌.HCV F反式激活新靶基因的发现,为进一步研究HCV F蛋白的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定了基础.     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B反式激活基因的克隆化研究

目的应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白4B(NS4B)转染细胞差异表达cDNA消减文库,克隆HCV NS4B蛋白反式激活相关基因.方法以HCV NS4B表达质粒pcDNA3.1(-)-NS4B转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,进行抑制性消减杂交分析.将富集的二次PCR产物与T/A载体连接,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑取克隆聚合酶链反应(PCR)扩增后进行测序及同源性分析.结果文库扩增后得到33个阳性克隆,经菌落PCR分析显示其中28个克隆含有大小不等的200～1000 bp插入片段.测序及同源性分析显示,12种已知基因编码蛋白,包括一些与细胞周期、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因,可能是NS4B反式激活靶基因.结论成功构建了HCV NS4B反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,为进一步阐明HCV NS4B反式调节的靶基因在肝炎、肝纤维化和肝细胞癌发生的分子生物学机制提供理论依据.     

恩替卡韦耐药乙型肝炎病毒稳定复制细胞系的转录组学分析

目的 分析恩替卡韦耐药乙型肝炎病毒(ETV-r HBV)稳定转染前后宿主细胞转录组水平的基因差异表达,为后续开展HBV感染相关机制研究提供基础数据和参考.方法 对ETV-r HBV稳定转染细胞株(HepG2.A64)及其原始背景细胞株(HepG2)进行转录组测序(n=3),利用DESeq2软件以|log2 Fold C...     

基于斑马鱼模型探究多花黄精多糖的免疫调节作用

目的：探讨多花黄精多糖(Polygonatum Cyrtonema Hua Polysaccharides, PCP)及PCP-1对氯霉素所致免疫损伤的保护作用。方法：采用水提醇沉法得到黄精粗多糖,除蛋白脱色素后,得到PCP。利用DEAE-Sepharose Fast Flow层析柱和HW-55F凝胶柱先后对PCP进行洗脱,收集洗脱液,减压浓缩,冷冻干燥后得到纯化的PCP-1。以受精后2 d(2 dpf)的转基因斑马鱼为实验动物,采用不同浓度的氯霉素处理,通过比较斑马鱼尾部中性粒细胞的数目,确定氯霉素的最优造模剂量,建立斑马鱼免疫抑制模型。分别加入不同浓度的PCP和PCP-1孵育24 h后,拍照统计斑马鱼泄殖腔至尾部中性粒细胞数目,观察PCP和PCP-1的免疫调节作用。结果：PCP-1为均一多糖,分子量为3 350 Da。与溶剂对照组比较,氯霉素组的中性粒细胞数目显著减少(P<0.01);与氯霉素组比较,在实验剂量范围内,PCP和PCP-1均可以增加斑马鱼体内中性粒细胞的数目(P<0.01),且量效关系明显。结论：PCP和PCP-1均具有一定的增强免疫活性及改善免疫损伤的作...     

动态心电图联合心脏彩超检查对急性心肌梗死诊断和预后评估的效果

目的：探究动态心电图联合心脏彩超检查对急性心肌梗死（AMI）诊断和预后评估的效果。方法：回顾性选取2021年1月—2022年12月在江苏大学附属武进医院就诊的93例疑似AMI患者,所有患者均进行冠状动脉造影（CAG）、动态心电图、心脏彩超检查,根据CAG诊断结果将患者分为观察组（AMI患者,60例）和对照组（非AMI患者,33例）。心脏彩超比较观察组与对照组心功能,动态心电图比较心率变异性指标[窦性心搏间标准差（SDNN）、QT间离散度（QTd）、校正后QT离散度（QTcd）]与心率震荡指标[震荡起始（TO）、震荡斜率（TS）]。有26例AMI患者保留6个月随访资料,根据随访期间患者是否出现主要不良心脏事件（MACE）为标准,将观察组分为MACE组（9例）与非MACE组（17例）,比较MACE组与非MACE组各指标差异。结果：联合诊断灵敏度、特异度、准确率均高于动态心电图及心脏彩超单项诊断,差异有统计学意义（P <0.05）。观察组患者TO、QTd、QTcd均显著高于对照组,LVEDD、LVESD显著大于对照组,TS、SDNN、LVEF均显著低于对照组（P <0.05）。M...     

获得性免疫缺陷综合征患者胃黏膜组织人类免疫缺陷病毒感染分析

Objective To investigate the distribution and amount of human immunodeficiency virus (HIV) infection in gastric mucosa from untreated acquired immune deficiency syndrome (AIDS) patients and highly active antiretroviral therapy (HAART) treated patients.Methods Thirty-five AIDS patients (14 untreated patients and 21 patients receiving HAART) and 10 HIV-1 seronegative patients with gastrointestinal symptoms were enrolled and examined by upper endoscopy.The labeled HIV-1 double-stranded cDNA probe was a PCR product corresponding to the LTR and gag gene of the HIV-1 genome.HIV in gastric mucosal tissues from AIDS patients was detected using in situ hybridization (ISH) and compared with that in peripheral blood mononuclear cells (PBMC).Results ① No obvious character was found in gastrointestinal symptoms,endoscopy examination and pathology results of AIDS patients.② The expression of HIV gene was mainly detected in the gastric mucosal mononuclear cell (MMC).Other cells were also observed with HIV expression including mucosal epithelial cells,gland epithelial cells and interstitial cells.③There was no difference in HIV expression between sinus ventriculi and gastric body.④ HIV gene expression from AIDS patients was (1.97±3.25)% in gastric mucosa,no difference in HIV gene expression between two groups (P＞0.05).⑤ HIV gene expression in PBMC smear from AIDS patients was (12.38 ± 9.17)%.HIV expreesion in PBMC from patients who had received HAART for 1-4 years were markedly lower than that from patients who had not received HAART (P＜0.05).Conclusions The gastric mueosa is one of HIV infected sites.The potential effect of HAART on the decrease of HIV infected cells in gastric mucosa was unsatisfactory.     

乙型肝炎病毒表面抗原主蛋白上调硫氧还蛋白还原酶1基因的表达

目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原主蛋白(SHBs)对硫氧还蛋白还原酶1(TXNRD1)启动子转录的激活作用.方法 以我室构建的SHBs基因表达谱芯片结果为基础,利用生物信息学技术确定TXNRD1的启动子区域(TXNRD1p),聚合酶链反应(PCR)扩增TXNRD1p,克隆至真核报告载体pCAT3-Basic中,构建pCAT3-TXNRD1p报告载体;以该质粒转染肝癌细胞系HepG2细胞系,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性;并与pcDNA3.1(-)-SHBs共转染HepG2细胞系,用ELISA法检测CAT的表达活性.结果 pCAT3-TXNRD1p与pcDNA3.1(-)-SHBs瞬时共转染的HepG2细胞的CAT表达活性是pCAT3-TXNRD1p的7.4倍,是pCAT3-TXNRD1p与pcDNA3.1(-)-empty共转染的2.5倍.结论 我室克隆的TXNRD1启动子有顺式激活下游基因的活性;HBV的SHBs蛋白可以上调TXNRD1的启动子活性.     

自身抗体对原发性胆汁性肝硬化的诊断意义

[目的]分析原发性胆汁性肝硬化(PBC)出现的自身抗体及其临床意义，探讨自身免疫性肝病重叠综合征的特点。[方法]用间接免疫荧光法检测52例PBC患者的ANA、AMA、SMA和LKM、LMA及LSP等抗体，用欧蒙印迹法检测ANA谱、AMA亚型抗体及SLA／IP、LKM—1和LC—1等肝脏疾病相关的自身抗体。[结果]全部PBC患者AMA和AMA—M2抗体均为阳性，52例中18例检测了AMA—M4、M9抗体，分别有9例和8例阳性。52例中ANA阳性41例(78．4％)，主要表现为细胞核膜型(19例)、核点型(11例)和着丝点型(8例)的荧光模式。其他少见的荧光模式有：抗SS—A/SS—B型、核均质型、核仁型及核颗粒型。多数PBC患者ANA为两种荧光模式的混合。荧光模式为着丝点型者CENP—B均为阳性。52例中有6例患者表现为自身免疫性肝病重叠综合征，其中2例SLA／IP阳性，提示AIHⅢ型与PBC的重叠；1例LKM—1阳性，提示AIHⅡ型与PBC的重叠；3例．ANA阳性，肝活检证实2例存在自身免疫性肝炎(AIH)和PBC的病理改变，1例仅有界面性炎的改变，提示AIHⅠ型与PBC的重叠综合征。重叠综合征男：女=4：2，年龄偏低，疾病进展较快。[结论]AMA和AMA—M2对PBC具有诊断意义；多数PBC患者ANA阳性并且有其特征性荧光模式，这种特征对AMA—M2阴性的PBC有诊断意义。PBC患者出现AIH的自身抗体时应考虑重叠综合征的诊断。此类重叠综合征患者在发病年龄、性别及抗体方面有不同于PBC的特点。     

58例原发性胆汁性肝硬化患者抗线粒体抗体和抗核抗体的特征分析

目的 分析原发性胆汁性肝硬化（PBC）患者出现的抗线粒体抗体（AMA）和抗核抗体（ANA）及其特征。方法 对58例确诊的PBC患者采用间接免疫荧光法（IFA）检测AMA、ANA，进一步采用酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫条带法分别检测AMA和ANA的亚型抗体。结果 58例PBC患者AMA抗体均为阳性，89．2％的患者AMA的滴度≥1：320；AMA亚型M2、M4和M9的检出率分别为100％、75．9％和24．1％。M2≥200RU／L的患者丙氨酚转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、γ-谷氨酰转氨酶（GGT）、碱性磷酸酶（ALP）、总胆红素（TBil）明显高于M2〈200RU／L的患者。M4阳性组ALT、AST明显高于M4阴性组。25．9％的患者出现了ANA，ANA的主要荧光模式为着丝点型11例、核膜型9例、核点型5例，集中出现在AMA高滴度以及M2≥200RU／L的患者。结论 PBC患者一般均有高水平的AMA和M2，且滴度和病情相关。M4、M9在PBC有一定的检出率。多数PBC患者还伴有高滴度的ANA并有主要的荧光模式。     

急性脑梗死患者血浆ATⅢ、FDP、D-D水平检测的临床意义

目的探讨抗凝血酶Ⅲ（ATⅢ）、纤维蛋白／纤维蛋白原降解产物（FDP）、D-二聚体（D-D）在急性脑梗死诊疗中的临床意义。方法选择2013年8月至2013年12月神经内科收治的急性脑梗死患者80例为观察组,选择同期健康体检人员80例为对照组,分别检测两组人员的血浆ATⅢ、FDP、D-D。结果观察组ATⅢ活性（78．45±16．47）％低对照组（99．83±19．11）％,差异有统计学意义（P〈0．05）,而血浆D—D和FDP均明显高于对照组,差异均有统计学意义（P〈0．05）O结论急性脑梗患者存在血浆ATⅢ、D-D、FDP水平的异常,及早检测有助于早期诊断和病情判断,值得临床推广使用。