重组人截短型胰岛素样生长因子1在大肠杆菌中的高效表达

目的：建立人截短型胰岛素生长因子１的原核高效表达系统。方法：利用基因重组技术将人人截短胰岛素样生长因子１「Ｄｅｓ（１－３）ＩＧＦ１」的ｃＤＮＡ片段克隆到融合蛋白表达载体ｐＭＴＹ４中,用离子交换层析法纯化蛋白并经ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳,放射免疫检测,Ｎ－末端前１６位氨基酸序列测定及生物活性检测等方法对所获蛋白进行了鉴定。结果;获得含人Ｄｅｓ（１－３）ＩＧＦ１基因的重组质粒,在大肠杆菌中高效表达出含     

醒脑益智组分中药对AD模型大鼠学习记忆障碍的实验研究

目的:观察醒脑益智组分中药对阿尔茨海默病模型大鼠学习记忆功能障碍的影响。方法:分别采用D-gal腹腔注射、Aβ1-40海马内注射以及二者复合造模的方法建立AD动物模型,以Morris水迷宫法筛选适宜动物模型; Wister大鼠随机分为假手术组、AD模型组、石杉碱甲0. 05 mg/kg组、醒脑益智组分中药179. 2mg/kg、89. 6 mg/kg、44. 8 mg/kg组,造模后连续给药30d进行行为学测试,记录Morris水迷宫实验中各组动物的逃避潜伏期、穿台次数、寻找平台的总路程及穿越平台象限路程;采用回避性条件反射-避暗实验观察各组大鼠的逃避潜伏期和记忆错误次数。结果:不同模型组大鼠水迷宫实验显示逃避潜伏期较造模前显著延长,穿台次数也较造模前减少,以复合造模组较为显著;定向航行实验中,各给药组大鼠较复合模型组逃避潜伏期降低,空间探索实验中,各给药组大鼠穿台次数较模型组增加,穿越第四象限的路程百分比也均有提高,以石杉碱甲0. 05 mg/kg组和醒脑益智组分中药179. 2mg/kg组作用较显著;避暗实验中,复合模型组大鼠造模后记忆潜伏时间缩短,且记忆错误次数增加;与复合模型组相比,石杉碱甲组和醒脑益智组分中药高剂量组大鼠记忆潜伏时间延长,记忆错误次数显著降低。结论:醒脑益智组分中药对复合造模致AD模型大鼠学习记忆障碍具有一定改善作用,且呈现剂量依赖性。     

二硫键稳定的双特异diabody的构建及表达

目的:在双特异diabody中设计和引入二硫键结构,提高其稳定性.方法:在抗HBsAg/RBC双特异diabody表达载体中分别将抗HBsAg或抗RBC抗体的轻重链可变区基因适当部位进行突变,引入半胱氨酸残基,使diabody结构中形成共价键.大肠杆菌中分泌表达或包含体表达.结果:使抗HBsAg/RBC双特异diabody的热稳定性和在尿素中的稳定性得到了较大程度的提高,改善了diabody的性能.结论:证明了diabody二硫键模型的可行性.     

人重组钙依赖性磷脂结合蛋白Ⅴ在大肠杆菌中的高效表达、纯化及细胞凋亡检测

目的：为细胞凋亡研究提供快速可靠的实验方法。方法：利用RT-PCR技术从人外周血单核细胞系U937 cDNA文库中扩增出编码钙依赖性磷脂结合蛋白Ⅴ（Annexin Ⅴ) cDNA,并克隆到大肠杆菌表达载体中,在大肠杆菌中表达含凝血酶识别序列的MS2 Annexin Ⅴ融合蛋白。表达产物经凝血酶消化,可除去MS2细菌蛋白,再经离子交换层析纯化,可得成熟的Annexin Ⅴ纯品,FITC标记后的Annexin Ⅴ可用于细胞凋亡的检测。结果：在大肠杆菌表达的人重组Annexin Ⅴ占菌体蛋白的56 %,经纯化获得99 %纯度的非融合型Annexin Ⅴ, FITC标记的Annexin Ⅴ能有效地检测凋亡细胞。结论：成功地建立了批量获取Annexin Ⅴ的技术路线,为推广高效检测凋亡技术提供了基础。     

凋亡相关蛋白TFAR19在TF-1细胞凋亡中出现细胞核转位

目的：探讨凋亡相关分子TFAR19 在TF-1细胞凋亡过程中的表达及定位。方法：以TFAR19的单克隆抗体为工具,采用荧光显微镜、共聚焦激光扫描显微镜、流式细胞仪等研究手段,观察细胞凋亡过程中TFAR19分子的表达水平和细胞内定位,分析其与细胞膜磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine, PS)以及细胞核DNA片段化的关系。结果：TFAR19蛋白在撤除GM-CSF的TF-1细胞中表达水平显著增高,伴有明显的核转位现象,且早于PS外翻和细胞DNA片段化。结论：TFAR19蛋白的核转位是细胞凋亡更早期发生的事件之一, 这一新发现为进一步探讨TFAR19蛋白的生物学效应,以及对细胞凋亡的多方位研究提供了新的线索和思路。     

利用NF-κB转录活性萤光素酶报告系统检测白细胞介素1及白细胞介素1受体拮抗剂的生物活性

目的:利用NF-κB转录活性萤光素酶报告系统,建立新的白细胞介素1(interleukin-1,IL-1)和白细胞介素1受体拮抗剂(interleukin-1 receptor antagonist,IL-1ra)生物学活性的检测方法.方法:运用萤光素酶转录报告系统,选用小鼠胸腺瘤细胞系EL4细胞(EL4的某些亚克隆细胞表面具有高密度IL-1受体表达),以pNF-κB-luc质粒和内对照pRL-TK质粒共转染,并加入IL-1β激活,以双萤光素酶报告基因检测系统检测IL-1β及其抑制剂IL-1ra的生物学活性.结果:这种方法检测到IL-1β激活NF-κB报告基因表达萤光素酶,并且这种激活可被IL-1ra所抑制,实验重复性好.IL-1β在5 μg/L为激活NF-κB报告基因表达萤光素酶的最佳浓度,并可被IL-1ra 50 μg/L最大抑制.结论:这种检测方法的建立为今后对IL-1β和IL-1ra的生物学活性检测提供了新的途径.     

我国人类功能基因研究与开发策略

2003年在纪念DNA双螺旋结构发表50周年之际,由美、英、日、法、德和中国科学家经过13年努力绘制的人类基因组全序列图终于完成,以序列分析为主的人类基因组计划的目标已经实现。     

人体基因治疗用VEGF质粒DNA的纯化与质控

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是特异性促进血管内皮细胞增殖的多肽生长因子.本文对用于基因治疗的人VEGF121真核表达质粒进行了批量纯化技术路线的研究,并率先在国内建立了人体基因治疗用表达质粒的质控指标.通过QIAGEN EndoFree Plasmid Mega Kit提取的pcD2/VEGF121质粒DNA,纯度好,超螺旋比例高,可直接用于基因治疗,动物实验已取得良好的效果.     

Cos - 7 细胞表达 I L- 2 - H B Vpre S 融合蛋白的免疫原性

为了协同白细胞介素－ ２（ Ｉ Ｌ－ ２） 和乙型肝炎病毒（ Ｈ Ｂ Ｖ） 前 Ｓ 抗原（ｐｒｅ Ｓ） 的多种生物学功能,用基因重组方法将表达 Ｉ Ｌ－ ２ｐｒｅ Ｓ 的质粒ｐ Ｃ Ｗ Ｉ Ｉ Ｐ 转染 Ｃｏｓ － ７ 细胞。该细胞分泌表达的 Ｉ Ｌ－ ２ｐｒｅ Ｓ 融合蛋白保留了 Ｉ Ｌ－ ２ 和ｐｒｅ Ｓ 抗原天然分子的生物学活性,且能增强ｐｒｅ Ｓ 抗原的免疫原性,产生协同作用,促进机体免疫应答。这可能为 Ｈ Ｂ Ｖ 持续性感染者寻找新的治疗方法提供理论基础与实验依据。