逆向案例教学法在医学微生物学教学中的应用

针对医学微生物学与临床医学的紧密联系性,以白喉棒状杆菌为例,介绍逆向案例教学法在医学微生物学教学中的内涵和实施步骤,总结逆向案例教学法与传统教学法相比所具有的优势和实施过程中应注意的问题,以便探讨其在医学微生物学教学中应用的可行性。     

生殖支原体MgPa原核载体的构建

[目的]构建生殖支原体(Mg)黏附蛋白MgPa优势表位基因(MgPa',1075～1364aa)的原核表达栽体.[方法]通过生物信息学分析,筛选并挑选MgPa基因优势抗原表位,以Mg G-37标准株基因组DNA为模板,高保真聚合酶链反应扩增目的片段,将其亚克隆到原核表达载体PET-30a( )中,构建重组质粒PET-30a( )/MgPa.[结果]PCR扩增得到大小约为870 bp的目的片段;构建的重组质粒经酶切鉴定和测序鉴定证明其中插入片段为MgPa目的基因,测序结果与Genbank上登录序列完全一致.[结论]采用上述方法可成功构建生殖支原体MgPa原核裁体.     

肺炎嗜衣原体临床株的分离鉴定与小鼠接种的初步观察

目的从临床标本中分离培养肺炎嗜衣原体,接种小鼠后对其进行初步观察。方法采用细胞培养法从临床标本中分离培养肺炎嗜衣原体;结合吉姆萨染色、间接免疫荧光、16SrDNA序列同源性和系统发育分析对其进行鉴定;建立动物模型对其毒力进行初步研究。结果从临床标本中分离的菌株NH001和NH002被鉴定为肺炎嗜衣原体,攻击小鼠后均产生明显肺部病理改变。结论成功分离培养出两株毒力较强的肺炎嗜衣原体菌株,为肺炎嗜衣原体相关研究提供了优质菌源。     

IFN-γ抗鹦鹉热衣原体急性感染保护作用研究

目的探讨IFN-γ对鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci,Cps)的抗感染作用,为进一步阐明机体抗衣原体免疫机制提供参考数据。方法不同浓度的重组人IFN-γ(5ng/mL、25ng/mL和50ng/mL)作用于感染Cps 6BC的HeLa细胞,48h后计数包涵体数量,并观察包涵体形态的改变。2×10~6 IFUs Cps 6BC滴鼻感染C57BL/6J小鼠,于感染前、后24h腹腔内注射10μg重组鼠IFN-γ,观察小鼠体重、活动状态、生存率等一般指标,分别于感染后5d和10d处死小鼠,取肝、肺组织进行HE染色检测其病理变化;并取感染后5d的肺组织,匀浆,计数其中Cps包涵体数量。结果感染48h后,Cps 6BC在5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL重组人IFN-γ处理的HeLa细胞中包涵体数量低于对照组(包涵体数分别为(23.8±5.1)×10~6,(10±3.58)×10~6,(8.0±2.22)×10~6,(43.3±11.05)×10~6,衣原体包涵体形状不规则,体积变小。小鼠实验显示,腹腔注射IFN-γ可明显提高Cps 6BC感染小鼠生存率,并减轻急性临床表现及脏器病变。结论 IFN-γ可发挥早期抗Cps感染的保护作用。     

鹦鹉热嗜衣原体基因组学的研究进展

目前7株鹦鹉热嗜衣原体(Chlamydophila psittaci,Cps)全基因组已测序完整,揭示了不同株之间的相同性与差异性。主要外膜蛋白基因、多形态膜蛋白多基因家族、Ⅲ型分泌系统基因和包涵体膜蛋白基因是鹦鹉热嗜衣原体研究的重点。对多个种株Cps基因组完整核苷酸序列测定的研究,将有助于进一步了解Cps的致病机制,寻找更好的诊断方法和防治措施,预防和控制Cps的流行。     

梅毒螺旋体TprF蛋白B细胞表位的预测与鉴定

目的 预测和鉴定梅毒螺旋体(Tp) 膜蛋白TprF氨基端保守区(TprF^N)的优势B细胞表位,为深入研究梅毒多价表位疫苗提供依据。方法 从GenBank获取TprF^N的氨基酸序列,采用Mobyle、ABCpred和IEDB在线软件综合分析预测TprF^N的B细胞表位并人工合成多肽;表达重组蛋白TprF^N并经Western blot鉴定后免疫兔,获取血清并测定抗体效价;以TprF^N免疫兔血清、梅毒患者血清(设正常人血清和正常兔血清为阴性对照),间接ELISA测定预测的7条人工合成的B细胞表位多肽的免疫反应性和特异性。结果 软件综合预测TprF^N的P1 (43-62AA)、P2(57-71AA)、P3(81-88AA)、P4(89-103AA)、P5(125-138AA)、P6(231-251AA)、P7(268-279AA)可能为B细胞表位;表达一可溶性蛋白,WB鉴定为目的 蛋白,其免疫抗体效价为1∶12 800以上;ELISA结果显示,预测表位P1、P3与TprF^N免疫兔血清及梅毒患者血清均呈阳性反应,而与对照血清均不反应。结论 P1、P3为TprF潜在的优势B细胞表位。     

梅毒螺旋体Tp0319重组蛋白的表达、纯化及其在临床诊断中的初步应用

目的克隆、表达及纯化梅毒螺旋体(Tp)外膜蛋白Tp 0319,并建立间接ELISA方法,探讨其在梅毒血清学诊断中的价值。方法构建重组质粒PQE32/Tp 0319,IPTG诱导表达,SDS-PAGE和western blot鉴定表达结果;Ni-NTA亲和层析法纯化重组蛋白,间接ELISA检测梅毒患者血清中特异性IgG抗体。结果成功构建了PQE32/Tp 0319重组质粒;经SDS-PAGE检测,诱导产物显示有一条相对分子质量约为30 000的特异蛋白质条带,western blot分析证明其只与人抗Tp IgG发生特异性反应;将Tp 0139用于间接ELISA检测抗Tp抗体阴、阳性参比血清,特异性和敏感性均为100%;检测梅毒患者和健康献血者血清各150份,结果与TPPA法符合率为95.3%。结论制备的Tp 0319重组蛋白有较好的免疫反应性,可望用于临床梅毒血清学诊断。     

梅毒螺旋体Gpd重组蛋白的表达

随着基因工程技术的迅速发展和梅毒螺旋体(Tp)全基因序列的解析^[1],通过重组技术已制备多种重组Tp抗原,并被广泛应用于梅毒血清学检测的研究和试剂盒的开发^[2-5],但对于哪一种Tp蛋白抗原在临床各期梅毒的血清学诊断中具有更高的特异性和敏感性尚无一致观点。我们应用软件筛选分析,选取抗原性较强的Tp外膜蛋白GPd进行克隆表达,并以重组蛋白为包被抗原,建立间接ELISA法,评价其在梅毒血清学诊断中的应用价值。     

解脲支原体药敏与tetM基因检测及生物群的研究

目的：了解泌尿生殖道支原体的耐药性机理,指导临床治疗。方法：采用微量肉汤稀释法测定281株UU对5种抗菌药物的最低抑菌浓度（MIC）,用PCR法扩增tetM基因并酶切,用UU MB抗原基因引物对 tetM基因阳性UU株进行生物群的研究。结果：281UU 82株对四环素MIC为16－256ug/ml,39株为8ug/ml,7株为4ug/ml,153株MIC＜4ug/ml;121株MIC大于等于8ug/ml及2株MIC＝4ug/ml者均出现377bp tetM基因阳性带;阳性检测率为43．77％。158株UU MIC小于等于4ug/ml未见类似扩增带,扩增产物用Hpa II酶切和电泳分析,均产生279bp和98bp两个特异性片段。281株UU用群特异性PCR分析,生物群1有166株,生物群2有115株,123株tetM阳性UU株,属生物群1,2者分别有54株和69株,分别占32．53％（54／166）和60．0％（69／115）（X2＝7．94,P＜0．05）,结论：（1）PCR技术检测泌尿生殖道感染患者UU耐药性tetM基因具有特异,敏感,快速等优点;（2）载有tetM基因的UU株可能成为四环素耐药株,应进行监测及随访;（3）我国衡阳地区UU四环素耐药株以生物群2占优势。     

海毒螺旋体外膜蛋白Gpd的基因型分析及其重组蛋白的免疫原性鉴定

目的构建梅毒螺旋体（Treponema pallidum，Tp）外膜蛋白Gpd基因的原核表达载体，检测其表达产物的免疫原性，并比较梅毒螺旋体各菌株Gpd基因序列的同源度。方法 从Tp Nichols株基因组模板中PCR扩增Gpd基因，与 GenBank登录的序列做blast比较，定向克隆构建原核表达重组体pET28b( )-Gpd，转入大肠杆菌ril表达菌，SDS-PAGE分析重组蛋白的表达，Western-blot检测重组蛋白的免疫原性。结果 载体上所连目的基因片段序列与GenBank登录的Nichols株Gpd基因序列完全一致,同其他病原性密螺旋体菌株登陆序列比较同源度为98%～100%。SDS-PAGE检测诱导产物显示有一Mr约为41 kDa的特异蛋白带，免疫印迹技术检测其能与梅毒阳性标准血清反应。结论 Tp原核表达重组体pET28b( )-Gpd成功构建，且能够在ril表达菌中融合表达，为进一步研究该蛋白的生物学功能奠定了一定的实验基础。