PAK6与HDAC6的相互结合诱导的细胞自噬在前列腺癌增殖中的作用

【立论依据】 前列腺癌 (prostate cancer,PCa)是男性恶性肿瘤的第一杀手。近期研究表明细胞自噬作为双刃剑在前列腺癌、乳腺癌等肿瘤的生理与病理过程中发挥重要的作用,但目前细胞自噬如何调控前列腺癌的机制尚无报道。p21活化激酶-6(p21-activated kinase 6,PAK6)是丝/苏氨酸蛋白激酶PAK家族的一员,通过磷酸化雄激素受体与肿瘤E3连接酶而泛素化降解雄激素受体,从而负向调节前列腺肿瘤的生长。HDAC6是Ⅱ类组蛋白脱乙酰化酶的一个成员,通过调节底物乙酰化水平促进肿瘤的生长与转化。已有文献报道,PAK6在前列腺癌中呈高表达,而HDAC6具有促进自噬小体形成的作用。我们前期的研究结果发现,PAK6可通过结合HDAC6从而诱导细胞发生自噬,且临床标本的免疫荧光结果显示PAK6与HDAC6共定位于细胞质中,且恶性前列腺癌中的共定位明显高于正常前列腺组织,提示两者在前列腺癌中发挥重要作用。因此本实验旨在探讨PAK6与HDAC6相互结合诱导的细胞自噬在前列腺癌中的发挥的生物学功能及调节机制。 【设计思路】 应用体内外结合实验研究二者在细胞内的相互作用。电镜及蛋白质印迹技术检测PAK6与HDAC6与细胞自噬的关系,及PAK6与HDAC6诱导的细胞自噬在前列腺癌中的生物学功能。免疫组化检测二者在前列腺癌临床标本中表达的相关性。 【实验内容】 (1)体外GST-pull down实验证实PAK6与HDAC6直接结合。(2)共转染HDAC6和PAK6到工具细胞HEK293中,免疫共沉淀检测二者在细胞内结合。(3)成功构建过表达和沉默PAK6细胞系,利用MTT,细胞计数及蛋白质印迹实验揭示PAK6与HDAC6诱导的细胞自噬在前列腺癌中的生物学功能。(4)免疫组化分析前列腺癌组织临床标本中PAK6与HDAC6表达的相关性。 【材料】 前列腺癌及工具细胞系,相应抗体, ECL发光试剂及仪器,共聚焦激光显微镜。 【可行性】 所在实验室为教育部医学细胞生物学重点实验室。前期实验成功证明PAK6和HDAC6的结合及共定位关系,本人已熟练掌握了后续实验涉及的相关技术。 【创新性】 本研究首次发现PAK6和HDAC6在前列腺癌中的共定位表达变化及二者的相互作用,阐明PAK6通过HDAC6促进细胞自噬,为寻找前列腺癌的预警分子提供理论基础。     

癌胚抗原启动子调控的白细胞介素-2/干扰素β融合基因的原核及真核表达质粒的构建

目的 根据细胞因子间协同作用特点,构建人白细胞介素-2（IL-2）与干扰素（IFN）β的融合基因,并用癌胚抗原（CEA）基因启动子调控其在结肠癌细胞株中的靶向表达.方法 分别用原核及真核表达载体,检测融合蛋白的表达情况.PCR、RT-PCR法扩增得到CEA启动子、IL-2 cDNA、IFNβ cDNA,应用原核表达质粒pGEX-5X-1、真核表达质粒pcDNA3.1/HisA、绿色荧光蛋白质粒pEGFP-C1,构建出原核表达质粒和真核表达质粒;SDS-PAGE电泳检测原核表达;用脂质体法将真核表达质粒转入结直肠癌细胞株Lovo（CEA高表达）、HT-29（CEA低表达）和对照Hela细胞（CEA阴性）,转染后分别以流式细胞仪、荧光显微镜、Western印迹等方法检测肿瘤细胞凋亡情况及蛋白表达情况.结果融合基因可在大肠杆菌及肿瘤细胞内表达融合蛋白;对肿瘤细胞有明显的杀伤作用;由CEA启动子调控的融合基因在Lovo细胞的表达高于HT-29细胞,在CEA阴性的Hela细胞中几乎不表达.结论 CEA启动子可靶向性调控融合基因在肿瘤细胞的表达,具有协同作用的细胞因子融合蛋白可能有更强的抗肿瘤作用.     

耳穴压丸结合认知行为用于高校女生慢传输型便秘的临床观察

慢传输型便秘(slow transit constipation,STC)为各种原因引起的结肠运动功能迟缓,传输粪便功能下降而导致的便秘.临床上以结肠通过时间延长和对纤维素、缓泻剂治疗反应差为特征[1].STC受多种因素影响,目前已知的STC病因主要包括药物副作用、泻剂滥用、内分泌紊乱、心理因素等方面.STC多发生于育龄妇女,女性激素异常,长期焦虑或忧郁均可致便秘.本课题组根据STC的发病机制,结合临床观察,发现高校女生为STC的高发人群.本文采用耳穴压丸结合认知行为疗法,对高校女生STC患者进行干预,效果满意,现报告如下.     

pGEX-5X-1-hLMO4原核质粒构建及重组蛋白表达

目的:构建hLMO4的原核表达载体并诱导、纯化和鉴定其表达。方法:hLMO4全长编码基因经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后,克隆至GST融合表达载体pGEX-5X-1,异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)在BL21大肠杆菌中诱导GST-hLMO4融合蛋白表达,利用Glutathione Sepharose 4B纯化诱导的融合蛋白,并经Western blot鉴定结果。结果:hLMO4编码序列克隆至pGEX-5X-1载体中,双酶切鉴定片段大小为500 bp,在E.coli BL21中IPTG诱导融合蛋白的表达,分子质量约为49 000 Da,成功纯化出GST及GST-hLMO4蛋白,Western blot检测到蛋白表达。结论:构建了hLMO4基因原核表达载体,鉴定了GST-hLMO4融合蛋白表达。     

应用二维电泳和质谱技术鉴定乳腺癌相关蛋白

目的 通过比较人乳腺癌细胞MCF7和乳腺上皮细胞MCF10A的差异表达蛋白,以发现可能用于早期诊断的乳腺癌肿瘤标志物.方法 体外培养人乳腺癌细胞MCF7和乳腺上皮细胞MCF10A,提取细胞总蛋白,进行二维凝胶电泳并比较分析,选择在乳腺癌细胞MCF7中明显差异表达的蛋白点,进行质谱和生物信息学分析.结果 建立了MCF7和MCF10A两种细胞系的二维凝胶电泳图谱,平均蛋白质点数分别为(960±44)和(1128±29);对选择的35个差异表达蛋白质点进行质谱和生物信息学分析,鉴定了其中16个点,包括过氧化氢酶-6(PRDX6)、磷酸甘油酸激酶-1(PGK1)、60 kD热休克蛋白(CH60)、谷氨酰胺转移酶-2(TGM2)等.结论 乳腺癌细胞MCF7相对于乳腺上皮细胞MCF10A的差异表达蛋白可能作为乳腺癌早期诊断和预后评价的候选肿瘤标志物.     

不同激酶活性的hPAK6基因原核表达载体的构建及重组蛋白的表达

目的 构建不同激酶活性的hPAK6原核表达载体并诱导和鉴定其融合蛋白表达.方法 野生型、激酶活型和激酶死型pcDNA3.1-PAK6经EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后,克隆至GST融合表达载体pGEX-5X-1,在E.coli BL21中诱导不同型GST-hPAK6融合蛋白表达,并经免疫印迹鉴定结果.结果 野生型、激酶活型和激酶死型hPAK6编码序列已被克隆至GST融合表达载体pGEX-5X-1,双酶切及测序鉴定正确,并在E.coli BL21中获得了诱导表达,蛋白的分子量均为101 kDa,免疫印迹检测到了融合蛋白表达.结论 成功构建不同激酶活性的hPAK6基因原核表达载体,并分别诱导表达出GST-PAK6融合蛋白.     

包膜外剥离法切除肝海绵状血管瘤一例

包膜外剥离法切除肝海绵状血管瘤一例刘树清，刘传启，李丰（河南周口地区人民医院普外科４６６０００）患者女性，５１岁。以上腹不适、纳差、腹胀半年为主诉入院。体检腹部未扪及包块，肝体积略大，右肋下２ｃｍ。Ｂ超肝右后叶可见约７×７ｃｍ大小强光团，边界清晰，形...     

力平脂治疗老年人高血脂症的疗效

力平脂治疗老年人高血脂症的疗效王春华，王文丽，赵学杰，李丰，陈朝蓬，孙天玉（中国人民解放军第１５３中心医院郑州４５００６５）力平脂（ｌｉｐａｎｔｈｙ，１００ｍｇ胶囊剂）是法国科尼大药厂生产的一种新型降脂药物，属苯乙酸类降脂药物。国内外应用效果良好。现...     

系统药理学(Ⅳ)在民族医药和组合药物领域的应用

目的我国的许多民族医药和组合药物在长期的临床实践中具有显著的疗效,但其活性成分及作用机制尚不清楚,我们探究了系统药理学方法在民族医药和组合药物的应用现状,以期为相关研究者提供参考。方法将系统药理学方法在藏医药、蒙医药、维吾尔医药等民族医药和组合药物两个领域的研究成果进行汇总、论述和分析。结果在民族医药的研究中,研究者们采用系统药理学方法科学的阐明了"血液质论"、"同病异治"等中医基础理论。在组合药物的研究中,我们发现系统药理学方法在解释中草药组合的合理性、减轻药物诱导的不良反应、解决不同患者之间的反应变异性等方面有着重大意义。结论系统药理学研究体系有助于阐释药物的药效物质基础、作用机制和中医基础理论,为民族医药的现代化发展、组合药物的研究提供了新方法学。     

低氧致鼠腺泡内肺动脉PDGF—B链蛋白表达的变化

目的：探讨血小板源性生长因子（ＰＤＧＦ）在低氧肺动脉高压血管构形重建发生中的作用。方法：应用免疫组化技术结合计算机图像分析，检测了低氧大鼠腺泡内肺动脉（ＩＡＰＡ）ＰＤＧＦ－Ｂ链蛋白表达水平。结果：常氧时，ＩＡＰＡ仅有ＰＤＧＦ－Ｂ链蛋白弱表达；低氧１天时，ＩＡＰＡ便有较强的ＰＤＧＦ－Ｂ链蛋白表达，定位于ＩＡＰＡ的内皮和中膜，低氧３天至１４天仅分布于中膜；低氧１、３、５、７、１４天各时间点ＰＤＧＦ－Ｂ链蛋白表达分别为常氧组的１．５３、１．５９、１．５６、１．６２和１．４２倍，差异有显著性（Ｐ＜０．０１）。结论：ＰＤＧＦ－Ｂ链蛋白可能参与了低氧肺动脉高压血管构形重建的发病过程