结节性硬化症分子生物学研究进展

结节性硬化症的分子病理机制尚未完全阐明,其致病基因TSC1和TSC2编码的错构瘤蛋白和结节蛋白具有肿瘤抑制作用,是细胞生长和增殖的重要调节因子。以往对结节性硬化症的研究多关注TSC1和TSC2基因缺失和突变,本文旨在对结节性硬化症的分子生物学研究进展做一综述。     

Pelizaeus-Merzbacher病的分子遗传学研究进展

Pelizaeus-Merzbacher病(PMD)是罕见的遗传性脑白质营养不良病,是由于蛋白脂蛋白(poteolipid protein 1,PLP1)基因的突变导致髓鞘不能正常形成所致,其中以PLP1基因的重复突变最多见.PLP1基因不同的突变可导致特定的疾病类型,且基因型和表型之间总体上存在对应关系.本文对PMD的分子遗传学特点及近期对该病分子、细胞机制的认识进行综述.     

稳定整合靶向细胞周期蛋白E1基因RNA干涉载体的肝癌细胞系的建立

目的探讨经载体介导的RNA干涉法建立周期蛋白E1表达稳定抑制细胞系的可行性。方法将源自pSSC-9质粒的neo基因亚克隆至干涉载体pSilencer 1.0-U6以构建稳定干涉载体pSineo,再将其与合成的靶向周期蛋白E1基因特定的RNA干涉模板片段连接,重组载体经脂质体LipofectamineTM2000介导法转染肝癌细胞株BEL-7402;转染细胞经G418筛选,常规抽提G418抗性克隆细胞的基因组DNA并行PCR法鉴定外源导入载体的稳定整合情况。结果酶切及测序鉴定结果均表明,重组载体pSineo-cyc E1符合预期设计;PCR鉴定结果显示,稳定筛选出的6个克隆均整合有靶向周期蛋白E1基因的干涉载体。结论本研究建立了6个稳定整合有靶向细胞周期蛋白E1基因RNA干涉载体的肝癌细胞系,为肿瘤的癌基因靶向干涉治疗作了有益探索。     

肾上腺脑白质营养不良的分子诊断（附2例报告）

目的 探讨肾上腺脑白质营养不良(ALD)的分子诊断方法。方法 在临床诊断的基础上，从2名患者外周血提取白细胞总RNA，进行反转录后，用PCR方法分四段扩增ALD基因编码区。纯化PCR产物，并对其进行序列测定。查出突变位点后，对患者家系成员的基因组DNA进行PCR-限制性酶切分析。结果 患者A的ALD基因第280位密码子发生CGC→CTC改变，使原来编码的精氨酸被亮氨酸取代(R280L突变)；患者B的ALD基因第508位密码子发生了CCC→CTC改变，使正常的脯氨酸被亮氨酸替换(P508L突变)。两个突变通过酶切分析和家系调查得到进一步确证。结论 建立了ALD的分子诊断技术，并在中国人ALD患者发现了两个新的ALD基因突变。     

福建地区遗传性高铁血红蛋白血症

遗传性高铁血红蛋白血症是一种主要由ＮＡＤＨ－细胞色素ｂ５还原酶（ｂ５Ｒ）缺陷所引起的遗传病,临床上分Ⅰ型和Ⅱ型。２０世纪８０年代以来,由于ｂ５Ｒ活性测定方法的建立,国内一共检出１１个患病家系,其中６个在福建地区。通过分子生物学方法对患者ｂ５Ｒ基因进行分析发现,在福建地区的６个家系中,有３个家系患者为Ａｒｇ５６Ｇｌｎ突变的纯合子,２个家系患者为Ｌｅｕ７２Ｐｒｏ突变的纯合子,１个家系患者为Ａｒｇ５７Ｇｌｎ突变与Ｃｙｓ２０３Ｔｙｒ突变的杂合子。所有家系的患者均为Ⅰ型,未发现Ⅱ型患者。福建地区可能是遗传性高铁血红蛋白血症的相对高发区。     

精子特异性人乳酸脱氢酶的原核表达与鉴定

精子特异性乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase—C4。LDH-C4）特异地存在于哺乳动物发育成熟的睾丸和精子细胞中，具有和其它同工酶不同的独特理化性质，与精子的生成、代谢、获能和受精有密切关系，为精子能量代谢的一个关键酶，其抗生育效果在多种哺乳动物，包括灵长类已得到证实。鉴于在分布上的特异性，LDH—C4一直被当作避孕疫苗的候选对象而受到重视。为了进一步研究LDH—C4的功能，制备针对LDH—C4的特异性抗体，我们构建了人精子特异性乳酸脱氢酶C（HLDH-C4）的原核表达载体，并进行原核表达和鉴定。     

精子特异性乳酸脱氢酶LDH-C4研究进展

自从1963年Goldberg等在多种哺乳动物、鸟类睾丸组织和精子中发现精子特异性乳酸脱氢酶C4（LDH—C4）以来。国内外对其分布的特异性及其与性成熟、生育过程的密切关系作了深入研究。近20年来。LDH—C4一直作为避孕疫苗的重要候选对象之一。受到国内外学者的关注。现就将近年来有关LDH—C4研究进展简要综述如下。     

孕妇血浆中的游离胎儿DNA及其意义

传统的产前诊断需要羊膜穿刺或绒毛膜取样，对母体和胎儿均有一定的危险性。胎儿有核细胞可存在于孕妇血循环中。并已被应用于非侵入性产前诊断，但由于母体外周血中胎儿有核细胞很少，每毫升仅含有1．2个细胞，且分离富集胎儿有核细胞的操作技术繁琐复杂。因此其应用受到限制。1997年Lo等首次证实孕妇血浆中存在着胎儿来源的游离DNA,为利用孕妇血浆进行非侵入性产前诊断提供了一条崭新途径。     

人甲胎蛋白基因启动子siRNA表达载体的构建及效应鉴定

目的：探索基于人甲胎蛋白基因启动子构建的siRNA表达载体介导目的基因RNA干扰的可行性，为实现肝癌细胞靶向RNAi治疗作一初步研究。方法：PCR法扩增获得人甲胎蛋白基因启动子并插入pSilencer1．0-U6中以置换其U6启动子；依据hLRH-1基因RNAi靶位点设计出siRNA模板DNA，体外合成相应寡核苷酸片段后经退火形成短双链，再克隆构建成靶向人hLRH-1基因siRNA表达载体；脂质体转染法将上述重组质粒转入HepG2细胞中，实时定量PCR法初步分析所建系统在AFP表达细胞中触发靶基因hLRH-1的RNAi效应，以及hLRH-1调控下游靶基因的表达改变。结果：获得人甲胎蛋白基因启动子驱动的siRNA表达载体pSiAFP。所建的RNAi载体系统可在表达AFP的HepG2细胞中有效诱导靶基因hLRH-1表达下调，抑制率约达85％；同时调控hLRH-1下游靶基因CyclinE 1与Oct4的表达相应下调。结论：人甲胎蛋白基因启动子驱动的siRNA表达载体可在表达AFP的HepG2细胞中有效介导靶基因的RNAi效应。     

siRNA表达载体介导的RNA干扰对肝癌细胞周期蛋白E1表达抑制研究

目的探讨经载体介导的RNA干扰对肝癌细胞周期蛋白E1表达抑制效率。方法针对周期蛋白E1基因设计并合成特定的RNA干扰模板片段，连接到pSilencer1．0-U6载体上构建siRNA真核表达载体；脂质体转染法将上述重组质粒转人BEL-7402肝癌细胞株。RT—PCR分析周期蛋白E1表达抑制率；流式细胞术测细胞周期S期和凋亡细胞比率；MTT比色法测定活细胞数并绘制细胞生长曲线。结果重组载体介导肝癌细胞BEL-7402周期蛋白E1抑制率达62％；转染重组质粒32h测得S期细胞为19％，空载体转染对照为27％；转染重组质粒96h流式细胞术测得凋亡细胞为13．1％，高于空载体对照的6．6％；细胞生长曲线作图表明，重组载体转染组细胞生长明显减缓。结论肝癌细胞周期蛋白E1的表达可被载体介导诱发的RNA干扰成功抑制，进而导致细胞生长受抑并诱导凋亡；本研究为探索肝癌的RNAi治疗提供了初步的实验依据。