基因工程苯丙氨酸解氨酶对多发性骨髓瘤U266细胞的作用研究

目的 为寻找对多发性骨髓瘤新的治疗方法 ,从基因工程乳酸乳球菌提纯苯丙氨酸解氨酶(PAL),探讨PAL酶对多发性骨髓瘤U266细胞系的影响作用.方法 利用已构建成功的高表达PAL的基因工程乳酸乳球菌,结合物理、化学、生物学等方法 ,设计一种简便、高效提纯PAL酶的方法.培养人多发性骨髓瘤U266细胞系,在不同浓度基因工程PAL酶作用后.以MTT法检测细胞增生;流式细胞仪检测细胞凋亡;HPLC检测细胞培养液中苯丙氨酸(phe)浓度.结果 ①用本研究所设计方法 从基因工程乳酸乳球菌NZ3900/pNZ8149-palart中提取的PAL酶比活性可达同量原菌的92.5%;②0.1～2.0U/ml的PAL提取液作用24h后能显著抑制U266细胞生长,并呈剂量依赖性;③只添加提取过程所用试剂的对照组细胞生长无明显抑制;④0.1U/ml、0.2U/ml、2.0 U/ml的PAL酶作用24h后的MM细胞早期凋亡率分别为(21.92±0.95)%、(50.64±0.86)%、(90.86±2.91)%;⑤PAL酶作用24h后细胞培养液中phe浓度随PAL酶活性增加而降低.结论 本研究所设计方法 可从基因工程乳酸菌高效提取PAL酶;提取过程中的添加试剂对MM细胞生长无明显抑制作用;PAL酶能显著抑制MM细胞体外生长,诱导细胞早期凋亡;PAL酶可降低培养液中的phe水平,且phe浓度与MM细胞生长的抑制作用具有相关性.     

凝血因子Ⅷ内含子ⅩbaⅠ多态位点检测及其在血友病A产前诊断中的应用

目的建立凝血因子Ⅷ（FⅧ）基因内含子22的Ⅹba Ⅰ多态位点高特异的基因连锁分析法，并应用于血友病A（HA）家系中孕妇携带者检测及产前基因诊断。方法用长距离PCR特异性扩增206个无血缘关系个体中FⅧ基因内含子226．2kb片段并进行Ⅹba Ⅰ酶切，计算Ⅹba Ⅰ多态性位点的基凶频率和多态信息量；用内含子22例位检测及FⅧ基因内Ⅹba Ⅰ，BclⅠ，HindⅢ和（CA）n二核苷酸重复序列多态性位点和FⅧ基因外DXS52多态性位点对20个HA家系进行间接基因诊断。结果ⅩbaⅠ多态性位点的基因频率和多态信息量分别是0．5475和0．4955；20个HA家系中，7个为内含子22倒位，13个非倒位家系中有6个家系Ⅹba Ⅰ均提供多态信息，其中2个家系只能用Ⅹba Ⅰ作出分子诊断，诊断率达46．15％；两个或两个以上连锁分析方法均提供多态信息的有8个家系。结论改进的FⅧ基因内Ⅹba Ⅰ多态位点是一个特异性高，信息量大的分子诊断标志。联合用22内含子倒位及Ⅹba Ⅰ等5种间接检测方法大大地提高了HA基因诊断率。是防止患儿出生，阻断致病基因传递的有效措施。     

实时荧光PCR技术的研究及其应用进展

聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)是一敏感特异的检测核酸分子的定性方法,在疾病的基因诊断中起重要作用,但传统的PCR技术在临床应用中遇到些难以克服的问题,如PCR后处理需手工操作、难以实现定量、PCR产物的污染等。近年,实时PCR(real-time PCR)技术实现了PCR从定     

唐氏综合征患者永生细胞系的建立

目的建立唐氏综合征患者永生细胞系，为唐氏综合征的基因诊断提供标准品。方法采集唐氏综合征患者外周血，采用EB病毒转化外周血B淋巴细胞和加环孢霉素A抑制T淋巴细胞的技术，建立永生淋巴母细胞系。用细胞遗传学方法、实时荧光定量PCR及短串联重复序列（STR）多态性分析技术检测其建系前后的遗传特性及稳定性。结果建系成功，经过传代、冻存和复苏，建系后第10代染色体核型和DNA标志未发生改变。建系前后染色体核型均为47，XX，＋21。多重荧光相对定量PCR鉴定，唐氏综合征患者外周血原代细胞和转化后第10代细胞株的△Ct值均在-2．55±3s范围内，与正常对照相比△Ct值范围无重叠。21号染色体上的STR基因座D21S11多态性分析表明，唐氏综合征患者外周血原代细胞和转化后第10代细胞株均有同样的3种基因型。结论染色体核型和DNA分析表明，唐氏综合征患者永生细胞系建立前后遗传特点一致，且稳定，可用作基因诊断试剂盒产品质量检测、质量控制的标准品。     

对急性B淋巴细胞白血病的克隆性、多样性及对化疗药物敏感性的探讨

本文应用聚合酶链反应(PCR)及半巢式聚合酶链反应(nest-PCR)的方法,观察了50例急性B淋巴细胞白血病患儿,免疫球蛋白重链(IgH)基因第三高变区(CDR-Ⅲ)扩增产物图谱。所测患儿中的84％有扩增产物带,其中81％扩增带为一条,各扩增带长度有所不同,显示出白血病细胞的克隆性及高度的多样性。对其中28例进行了骨髓细胞形态学及PCR或nest-PCR扩增情况的近期追踪观察,发现后者既敏感又客观,而且PCR特异扩增带消失快慢的不同,可能与患儿对化疗药物敏感程度不同有关。因此,PCR可作为了解患者对药物敏感的程度,指导制订和调整化疗方案的一种简便易行的方法。     

白血病患者WT1基因表达的研究

目的：探讨WT1基因与白血病发病的关系和临床意义。方法：采用逆转录－巢式聚合酶链反应（RT－巢式PCR）方法检测了K562和HL－60两个白血病细胞系、49例急性白血病（AL）患者、33例慢性髓系白血病（CML）患者和25例正常对照的WT1基因表达。结果：K562和HL－60两个白血病细胞系、29例初治或复发AL患者中有21例、20例完全缓解（CR）期AL中有1例、18例CML急变期中有15例、5例CML加速期中有1例、10例CML慢性期患者中有1例表达WT1基因。WT1基因表达见于所有AL亚型，其相对水平与急性白血病的CR率有相关性。≥1．0的患者CR率低及生存期短。在CML中WT1基因表达表现出明显的阶段性，与慢性粒细胞白血病临床阶段及病情进展有关。结论：WT1基因表达与白血病发生有关，WT1基因高表达的患者CR率低、无病生存期短，可作为判断急性白血病预后和监测微量残留病的一项指标，也可作为CML急变的一项诊断指标。     

对急性B淋巴细胞白血病残留病检测技术的改进及其临床应用

将文献报道的聚合酶链反应(PCR)与核糖核酸酶(RNase)保护实验结合检测微小残留病的技术加以改进,免去了其中的放射性同位素的应用,代之以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),使经RNase酶解后代表残留病的双链RNA片段扩增百万倍,经常规凝胶电泳即可观察结果。将此技术与半巢式聚合酶链反应(seminest-PCR)相结合,对8例急性B淋巴细胞白血病患儿体内残存的白血病细胞进行了连续追踪观察,至持续缓解6个月时(最长1例为9.5个月),其中6例可见残存的白血病细胞,反映了此技术在检测残留病方面的可行性。     

凝血因子Ⅷ内含子X ba Ⅰ多态位点检测及其在血友病A产前诊断中的应用

目的建立凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因内含子22的 Xba Ⅰ多态位点高特异的基因连锁分析法,并应用于血友病 A(HA)家系中孕妇携带者检测及产前基因诊断。方法用长距离 PCR 特异性扩增206个无血缘关系个体中 FⅧ基因内含子226.2 kb 片段并进行Ⅹba Ⅰ酶切,计算Ⅹba Ⅰ多态性位点的基因频率和多态信息量;用内含子22倒位检测及 FⅧ基因内Ⅹba Ⅰ,Bcl Ⅰ,Hind Ⅲ和(CA)n 二核苷酸重复序列多态性位点和 FⅧ基因外 DXS52多态性位点对20个 HA 家系进行间接基因诊断。结果ⅩbaⅠ多态性位点的基因频率和多态信息量分别是0.5475和0.4955;20个 HA 家系中,7个为内含子22倒位,13个非倒位家系中有6个家系Ⅹha Ⅰ均提供多态信息,其中2个家系只能用Ⅹba Ⅰ作出分子诊断,诊断率达46.15%;两个或两个以上连锁分析方法均提供多态信息的有8个家系。结论改进的 FⅧ基因内Ⅹba Ⅰ多态位点是一个特异性高,信息量大的分子诊断标志。联合用22内含子倒位及Ⅹba Ⅰ等5种间接检测方法大大地提高了 HA 基因诊断率,是防止患儿出生,阻断致病基因传递的有效措施。     

CD44在胃癌中异常表达的临床意义

胃癌的转移和扩散是依靠细胞与细胞外间质及其他细胞的一系列的相互作用,其中肿瘤细胞表面的粘附分子在这一过程中起着重要作用。细胞粘附分子CD_(44)是一种存在于细胞表面的跨膜糖蛋白,能介导淋巴细胞归巢并参与细胞—细胞间粘附,在肿瘤的发生、发展和转移中起重要的作用。人类CD44基因位干第11号染色体短臂上,由20个高度保守的外显子构成,它包括10个组成型外显子和10个V区变异性拼接外显子。组成型外显子的转录片段存在于所有CD_(44)转录子中,仅含有组成型外显子的CD_(44)转录子称作标准型CD_(44s)转录子。V区外显子在转录时可以随机拼接,也可以跳跃的方式拼接,这些有变异型拼接外显子插入的CD_(44)转录子称为变异型CD_(44v)转     

Detection of factor Ⅷ intron 1 inversion in severe haemophilia A

Objective Screening the intron 1 inversion of factor Ⅷ (FⅧ) in the population of severe haemophilia A(HA) in China and performing carrier detection and prenatal diagnosis. Methods Using LD-PCR to detect intron 22 inversions and multiple-PCR within two tubes to intron 1 inversions in sereve HA patients. Carrier detection and prenatal diagnosis were performed in affected families. Linkage analysis and DNA sequencing were used to verify these tests. Results One hundred and eighteen patients were seven diagnosed as intron 22 inversions and 7 were intron 1 inversions out of 247 severe HA patients. The prevalence of the intron 1 inversion in Chinese severe haemophilia A patients was 2. 8% (7/247). Six women from family A and 2 from family B were diagnosed as carriers. One fetus from family A was affected fetus. Conclusion Intron 1 inversion could be detected directly by multiple-PCR within two tubes. This method made the strategy more perfective in carrier and prenatal diagnosis of haemophilia A.