丙型肝炎病毒F蛋白反式激活蛋白2基因在酵母细胞中的表达

目的为探讨丙型肝炎病毒(HCV)F蛋白反式激活蛋白2(HCV FTP2)的功能,在真核生物酵母细胞中表达HCV FTP2基因.方法以HepG2细胞来源的mRNA作为模板,经过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增HCV FFP2基因,克隆到pGEM-T载体中,双酶切后回收连接到酵母表达质粒pGBKT7中表达.提取酵母蛋白质,进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blot免疫印迹分析.结果成功构建HCV FTP2基因酵母表达载体,Western blot免疫印迹显示HCV FTP2基因在酵母细胞中表达成功.表达产物相对分子质量27kD.结论HCV FTP2在酵母中表达成功.     

应用抑制性消减杂交技术克隆筛选丙型肝炎病毒F蛋白结合蛋白2反式激活基因

目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建新基因丙型肝炎病毒F蛋白结合蛋白2(HCVFBP2)反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,克隆HCVFBP2反式激活相关基因.方法:以HCVFBP2表达质粒pcDNA3.1(-)-FBP2转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)转染的HepG2细胞为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaⅠ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制多聚酶链反应(PCR),将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:成功构建人类新基因HCVFBP2反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后选取48个克隆,进行菌落PCR分析,均得200～1000bp插入片断.挑取30个克隆进行测序,通过生物信息学分析获得28个已知功能基因序列和2个未知功能基因.结论:应用SSH技术成功构建了HCVFBP2反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.该文库的建立为阐明HCVFBP2生物学功能提供理论依据.     

乙型肝炎病毒X蛋白上调白细胞介素-18基因的表达

目的:了解乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)与白细胞介素-18(IL-18)基因表达的关系,研究HBxAg在HBV致病的分子生物学机制中的作用.方法:聚合酶链反应(PCR)扩增人IL-18基因启动子DNA,命名为IL-18P.以T-A克隆法,将IL-18P基因片段连入载体pGEM-T.将获得的质粒pGEM-T-IL-18P,与报告质粒pCAT3-basic分别用KpnⅠ和BglⅡ双酶切后构建IL-18启动子报告基因表达载体pCAT3-IL-18P,以重组表达质粒pCAT3-IL-18P和HBxAg表达载体pcDNA-HBxAg瞬时转染HepG2细胞,以转染pCAT3 basic的HepG2细胞为阴性对照,48小时后收获细胞.用酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞中氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性,以了解乙型肝炎病毒X蛋白对IL-18基因表达的影响.结果:构建的报告基因表达载体pCAT3-IL-18P经过序列分析和酶切鉴定正确.真核表达载体pcDNA3.1(阴性)-X和pCAT3-IL-18P共转染的HepG2细胞的CAT表达活性是pCAT3空载体的6.2倍,是pCAT3-IL-18P的1.17倍.结论:乙型肝炎病毒X蛋白可上调IL-18启动子的转录活性,促进IL-18基因表达.     

人肝再生增强因子下调钙结合蛋白S100A11基因表达的研究

目的 探讨人肝再生增强因子（ALR）对钙结合蛋白S100A11启动子（S100A11p）转录的调节作用。方法 利用生物信息学技术确定S100A11P区域，聚合酶链反应（PCR）扩增S100A11p，克隆至真核报告载体pCAT3中，构建PCAT3-S100A11P报告载体；以该质粒转染HepG2细胞系，用酶联免疫吸附法（ELISA）检测报告基因编码产物氯霉素乙酰转移酶（CAT）的表达活性。并以人ALR的真核表达载体pcDNA3．1（-）-ALR共转染的HepG2细胞系，用酶联免疫吸附法（ELISA）检测CAT的表达活性。结果pCAT3-S100A11p在HepG2细胞中具有CAT的表达活性；以pcDNA3．1（-）-ALR和pCAT3-S100A11p共转染HepG2细胞，CAT表达活性是单独转染细胞组pCAT3-S100A11p的0．42倍。结论 所克隆的S100A11启动子有启动子的转录活性，ALR的转基因表达具有对S100A11基因的下调作用。     

应用抑制性消减杂交技术筛选乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白的下调基因

目的筛选与克隆乙型肝炎表面抗原大蛋白(LHBs)的下调基因,以阐明HBV感染相关性疾病的分子生物学机制.方法应用常规分子生物学方法,克隆LHBs基因,构建真核表达质粒pcDNA3.1(-)-LHBs.将pcDNA3.1(-)-LHBs与pCAT3-promoter共转染肝癌细胞系HepG2,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性.分别以pcDNA3.1(-)-LHBs以及pcDNA3.1(-)转染HepG2细胞,提取mRNA并逆转录为cDNA,来源于pcDNA3.1(-)-LHBs转染细胞的cDNA为驱动(driver),来源于pcDNA3.1(-)的cDNA为测试(tester),进行抑制性消减杂交分析,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆进行测序及同源性分析.结果 ①成功构建pcDNA3.1(-)-LHBs真核表达载体;②pcDNA3.1(-)-LHBs与pCAT3-promoter共转染HepG2细胞的CAT表达活性较对照组的活性明显下降(P＜0.01),抑制率达93.9%;③成功构建人LHBs下调基因的cDNA消减文库.通过生物信息学分析获得14种编码基因.结论 LHBs是HBV基因组编码的一种反式调节因子,可以下调SV40早期启动子的活性.筛选到的LHBs下调的cDNA全长序列,包括与抗氧化防御、细胞生长调节、免疫及细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因,以此可以推测LHBs存在的调控机制以及HBV的致病(癌)机制.     

原位再生医疗技术治疗肛肠疾病术后创面疼痛的疗效分析

目的探讨原位再生医疗技术治疗肛肠疾病术后创面疼痛的临床疗效。方法将2015年1月—2016年12月清镇市中医院普外科收治的161例肛肠疾病患者随机分为试验组(82例)与对照组(79例),试验组患者术后创面应用湿润烧伤膏治疗,对照组患者术后创面应用马应龙麝香痔疮膏治疗,对比观察两组患者的创面疼痛情况及住院时间。结果试验组患者住院时间为(6.11±2.13)d,使用盐酸哌替啶止痛者(即严重疼痛者)4例,使用盐酸曲马多止痛者(即重度疼痛者)6例,使用氯诺昔康止痛者(即中度疼痛者)16例,未使用镇痛药物者(即无疼痛或轻度疼痛者)56例;对照组患者住院时间为(8.36±2.26)d,使用盐酸哌替啶止痛者(即严重疼痛者)54例,使用盐酸曲马多止痛者(即重度疼痛者)16例,使用氯诺昔康止痛者(即中度疼痛者)9例,未使用镇痛药物者(即无疼痛或轻度疼痛者)0例。两组患者住院时间及镇痛药物使用情况对比,P均0.01,差异具有统计学意义。结论原位再生医疗技术治疗肛肠疾病术后创面,可有效缓解术后创面疼痛,促进创面愈合,缩短患者住院时间,值得临床推广应用。     

弥漫性轴索损伤患者胼胝体DTI纵向评估

目的 评价亚急性期弥漫性轴索损伤(DAI)患者胼胝体各亚区域微观结构及其短期变化.方法 连续性纳入亚急性期DAI患者21例,其中12例于1月后(31.5 d±6.2 d,28~43 d)复查,招募12例性别、年龄匹配的健康对照组,所有受试者使用3.0T磁共振仪扫描获取脑部DTI数据.在矢状位各向异性分数(FA)图将胼胝体分为6个亚区域(胼胝体膝部、体嘴部、体前部、体后部、峡部及压部)计算FA值、表观扩散系数(ADC)值,分析亚急性期和随访患者胼胝体DTI参数变化,并将亚急性期患者胼胝体各亚区域DTI参数与入院时格拉斯哥(GCS)评分做相关分析.结果 亚急性期患者整个胼胝体及所有亚区域FA值显著降低,除胼胝体体前部、体后部外其余亚区域ADC值均显著升高(P<0.05),其中胼胝体峡部FA值下降幅度最大(-12.0%).12例随访患者整个胼胝体及各亚区域FA值和ADC值变化均无统计学意义(P>0.05).亚急性期患者整个胼胝体、峡部及压部FA值与入院时GCS评分呈正相关(整个胼胝体:r=0.848,P=0.000;峡部:r=0.447,P=0.048;压部:r=0.591,P=0.006).结论 胼胝体峡部是DAI最易损伤的部位;短期内(1个月)胼胝体亚区域微观结构无显著变化;亚急性期DAI患者整个胼胝体FA值能较好反映DAI患者损伤程度.     

肝细胞癌合并周围型动-门静脉瘘介入治疗方案及效果

目的探讨肝细胞癌合并周围型动-门静脉瘘(artery-portal fistula,APF)介入治疗方案及效果。方法选取2009年8月至2016年9月于首都医科大学附属北京地坛医院诊治的肝细胞癌合并周围型动-门静脉瘘(artery-portal fistula,APF)患者82例为研究对象。所有患者均经肝动脉化学栓塞(transcatheter arterial chemoembolization,TACE)治疗,根据术中造影显示的分流量选择1~2种栓塞剂,常用的栓塞剂为碘化油、罂粟乙碘油、明胶海绵颗粒栓塞剂(1400~2000μm),均用洛铂稀释后化疗灌注,观察并比较患者治疗后的疗效。结果介入治疗前合并食管胃底静脉曲张者51例,中度至重度腹水者30例,门静脉癌栓者41例,治疗后11例患者腹水症状消失,17例患者腹水明显减少。65例(79.3%)患者APF瘘口术后完全消失,11例(13.4%)瘘口部分闭合,15例患者术后继续治疗中发现APF瘘口再次复发,11例患者出现新的APF。52例(63.4%)患者肿瘤明显缩小,19例(23.3%)肿瘤增大,11例(13.4%)肿瘤无明显变化。术前59例甲胎蛋白阳性患者介入治疗后41例甲胎蛋白水平下降。术后有4例患者出现上消化道出血。随访中61例病死患者的中位生存期为11.4个月。结论对于肝细胞癌合并周围型APF患者,应根据不同分流量选择合理的栓塞剂,可有效缓解患者临床症状并提高生活质量,最大程度降低术后并发症。     

应用抑制性消减杂交技术筛选HBeAg结合蛋白1反式激活基因

目的筛选与克隆HBeAg结合蛋白1(HBEBP1)新基因的反式激活基因,了解其可能存在的调节功能线索。方法应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioinformatics)技术筛选并克隆HBEBP1反式激活的新型靶基因。以HBEBP1表达质粒pcDNA3．1(-)-HBEBP1转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaⅠ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与2种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与T／A载体连接,构建cDNA消减库,并转染大肠杆菌进行库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果成功构建人HBEBP1反式激活基因差异表达的cDNA消减库。库扩增后得到85个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到200～1000bp插入片段。对26个插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得15种编码基因,包括14种已知基因和1种未知基因。结论筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、信号转导、肿瘤免疫发生及细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因,推测了HBEBP1可能存在的调控机制的线索。