乙型肝炎病毒前-S1蛋白反式激活基因5的筛选克隆与重组蛋白诱导表达

目的 克隆人类乙型肝炎病毒(HBV)前-S1蛋白(pre-S1)反式激活新型靶基因PS1TP5.构建其原核表达载体,并诱导其在大肠埃希菌中表达.方法 以HBV前-S1表达质粒pcDNA3.1(-)-preS1转染HepG2细胞,空载体pcDNA3.1(-)作为平行对照,提取mRNA进行抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization, SSH)技术分析,结合生物信息学(bioinformatics)技术筛选得到人类新基因PS1TP5.应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,以提取的HepG2细胞mRNA为模板,扩增获得PS1TP5基因片段,选用pGEM-T载体进行TA克隆,通过PCR、限制性酶切分析及测序进行鉴定,再将其亚克隆到原核表达载体pET-32a( )中,转化进BL21(DE3)宿主菌,经IPTG诱导获得了PS1TP5重组蛋白的表达,表达产物进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)分析,考马斯亮蓝染色,以抗-His的单克隆抗体进行Western blotting免疫印迹分析证实表达蛋白的特异性.结果 成功扩增出PS1TP5基因.并将其插入pET-32a( )原核表达载体,经BL21(DE3)受体菌转化、IPTG诱导、SDS-PAGE分析获得了PS1TP5重组蛋白的表达,Western blotting证实了重组蛋白表达的特异性.结论 应用SSH、RT-PCR与生物信息学技术筛选克隆出PS1TP5基因,构建了pET-32a( )-PS1TP5原核表达载体,并利用大肠埃希菌原核表达系统成功获得了pET-32a( )-PS1TP5重组蛋白的表达.为进一步研究PS1TP5免疫原性及慢性乙型肝炎发病机制创造了条件.     

应用抑制性消减杂交技术筛选丙型肝炎病毒非结构蛋白2反式调节基因

目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白2(NS2)反式调节基因cDNA消减文库,研究HCV NS2蛋白的反式调节基因.方法:应用抑制性消减杂交(SSH)技术筛选转染pcDNA3.1(-)-NS2和空载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞差异性表达基因,并进行生物信息学分析.结果:获得12个差异表达的已知蛋白基因和3个未知功能基因序列,包括:磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican 3, GPC3)、酸性核糖体磷蛋白PO、核糖体蛋白L13a、整合素β1、天冬酰胺合成酶、信号肽酶、α-2-HS-糖蛋白、小核糖体蛋白多肽G、蛋白酶样亚单位、黄体酮受体、SDR家族脱氢酶8、Ras家族RAB4A、具有BTB/POZ结构的新蛋白、具有coiled-coil-helix结构的新蛋白、未知功能基因.结论:成功构建HCV NS2反式调节的相关基因cDNA消减文库,为今后进一步分析、研究病毒蛋白的致病机制提供了线索.     

血管紧张素Ⅱ对肝星状细胞基因表达的影响

目的观察血管紧张素Ⅱ对培养肝星状细胞(HSC)株LX2细胞基因表达的影响。方法以1×10~(-5)mol/L的血管紧张素Ⅱ与LX2细胞孵育48 h,对照组不加血管紧张素Ⅱ。收集实验组和对照组细胞,分别提取mRNA及总蛋白质,进行抑制性消减杂交和蛋白质双向电泳及质谱分析。结果抑制性消减杂交产物经两轮聚合酶链反应(PCR)扩增,结果显示为200～1000 bp大小不等的插入片段,挑选36个克隆测序,应用生物信息学技术分析,发现13个克隆与未知基因序列高度同源,其中GenBank号为BC097361、BC057380的基因为具有开放读码框架的完整基因。其余23个克隆均与已知基因的部分序列高度同源(98%～100%),主要相关基因包括β肌动蛋白、亮氨酰tRNA合成酶、基础免疫球蛋白2、丙酮酸激酶,过氧化物酶1、人类白细胞抗原-B关联转录物3等。在血管紧张素Ⅱ孵育的和阴性对照HSC的双向电泳图谱中分别探测到1110、1008个点,两个图谱有504个点匹配。其中108个点和对照相比明显上调(容积比＞1．5),153个点和对照相比明显下调(容积比＜0．67),选取其中相对容积上调的10对点进行质谱分析,其中8个点在数据库中检索得到相应结果,分别为抑素、电子转移黄索蛋白亚单位、超氧化物歧化酶2、三磷酸核苷酶等。结论血管紧张素Ⅱ处理后的HSC mRNA表达上调具有增殖加速、凋亡抑制和促进分化等生物学作用,部分上调蛋白质为细胞内信号传导蛋白质、代谢调控蛋白质、细胞凋亡抑制蛋白质以及纤维化相关调控蛋白质。     

应用基因表达谱芯片技术筛选乙型肝炎病毒HBsAg基因转染细胞差异表达基因

目的应用基因表达谱芯片技术研究乙型肝炎表面抗原(HBsAg)主蛋白的表达对肝母细胞瘤系HepG2基因表达谱的影响.方法设计并合成HBsAg主蛋白基因序列特异性的引物,以含有HBV全基因组的质粒G376 A7作为模板,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增HBsAg蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术构建表达栽体pcDNA3.1(-)-HBsAg.以脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较.结果在1152个基因表达谱的筛选中,发现有30个基因表达水平显著上调,29个基因表达水平显著下调.结论应用基因表达谱芯片成功筛选了HBsAg转染细胞后差异表达的基因,为深入研究HBsAg可能的生物学功能提供依据.     

有限椎板切除减压内固定术治疗退变性腰椎管狭窄症的近期疗效分析

[目的]探讨有限椎板切除减压内固定术治疗退变性腰椎管狭窄症的近期疗效.[方法]回顾性分析2007年8月～2009年8月,采取有限椎板切除减压内固定术治疗退变性腰椎管狭窄症且资料完整的患者41例,男16例,女25例;年龄44～72岁,平均57岁;病史6个月～10年,平均18个月.采用日本骨科学会(JOA) 15分法及疼痛视觉模拟评分法(VAS)对术前、术后和末次随访时的神经功能与自觉症状进行评估,计算改善率,并对结果进行统计学分析.[结果]随访15～32个月,平均26个月,术后3个月优良率为82.9％,术后26个月随访时优良率80.5％ (P＞0.05).比较术前,术后腰腿痛VAS评分明显减少(P＜0.01),JOA评分明显改善(P＜0.01),术后26个月与术后3个月无明显差别(P＞0.05).[结论]有限椎板切除减压内固定术是治疗退变性腰椎管狭窄症的一种可靠术式,把握好手术适应证与减压范围可以获得良好的疗效.     

大鼠脑皮质星形胶质细胞体外培养方法的改进

目的改进大鼠脑皮质星形胶质细胞体外培养方法,获得纯度较高的大鼠脑皮质星形胶质细胞。方法取出生后1d内SD大鼠大脑皮质,用机械吹打法使细胞分散制成初细胞悬液,10μm尼龙膜过滤除去成纤维细胞后接种。待7d细胞铺满瓶底后,"十"字形震荡培养液5min后传代接种。传代2次后行GFAP免疫组化染色鉴定。结果通过微孔尼龙膜过滤和传代前"十"字形震荡培养液等操作可以得到形态典型、纯度较高的星形胶质细胞。通过纯度计算可得离体培养的星形胶质细胞的纯度平均值为95.49%(n=6)。结论改进的星形胶质细胞体外培养方法,降低了实验操作难度,方法稳定有效,得到的星形胶质细胞纯度较高。     

不同剂量白藜芦醇对星形胶质细胞Aβ损伤的影响

目的研究白藜芦醇对β淀粉样蛋白诱导星形胶质细胞的超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)及丙二醛(MDA)释放的影响和其对氧化损伤的保护作用,从而探索其对中枢神经保护作用的可能机制。方法采用不同浓度的白藜芦醇预处理星形胶质细胞12h,继之用25μmol/L浓度的β淀粉样蛋白进行损伤,然后检测细胞SOD、GSH-PX及MDA释放的含量,并对数据进行统计学分析。结果β淀粉样蛋白损伤后,细胞SOD、GSH-PX的释放量明显下降(P<0.05),MDA的释放量升高(P<0.05),而用1、10、100μmol/L白藜芦醇预处理则能升高损伤细胞的GSH-PX的释放量(P<0.05),并能降低损伤细胞MDA的释放量(P<0.05);10、100μmol/L白藜芦醇预处理则能升高损伤细胞的SOD的释放量(P<0.05)。结论星形胶质细胞受到β淀粉样蛋白损伤后,白藜芦醇能增加SOD和GSH-PX的释放量,降低MDA的释放量,提示白藜芦醇对星形胶质细胞具有保护作用。     

两种穿刺材料减少甘露醇滴注所致静脉炎发生

目的通过两种穿刺材料的使用,探讨减少甘露醇致静脉炎发生的方法。方法将临床96例使用甘露醇颅内压增高患者随机分为两组,对照组48例使用9号头皮针进行穿刺,实验组使用24号静脉留置针穿刺,观察两组静脉炎发生的情况。结果实验组静脉炎的发生率明显低于对照组（X^2=17．46,P〈0．01）.结论24号静脉留置针能有效减少甘露醇滴注所致静脉炎的发生,减少病人痛苦。     

经皮腰椎间融合术治疗退变性腰椎不稳症

目的:观察经皮单枚B-twin椎体间融合术治疗退变性下腰椎不稳症的有效性.方法:对30例患者共32间隙实施了经皮穿刺椎间融合术,于手术前后对临床情况进行JOA评分,并行腰椎X光及CT检查对比.结果:随访时间3 ～38个月(平均16个月),根据JOA评分标准,临床治疗结果:优10例、良15例、可3例、差2例,优良率83....