骨髓基质干细胞-藻酸钙复合物构建骨组织的实验研究

目的 研究犬骨髓基质干细胞(BMSCs)体外成骨活性和在犬体内异位成骨能力，探讨其作为骨组织工程种子细胞的可能性。方法 抽取成年犬骨髓，梯度离心法获取单个核细胞，条件培养液体外培养、诱导、扩增后，进行组织化学、免疫细胞化学染色，透射电镜下观察其成骨活性。将培养的第3代细胞与藻酸钙所形成的复合物植于犬皮下，3月后行组织学检测。结果 体外培养的BMSCs Von Kossa染色可见钙结节，AKP染色及I型胶原、Osf2／Cbfαl、骨钙素免疫细胞化学染色先后呈现阳性；透射电镜下见基质钙化；组织学检测提示细胞一藻酸钙复合物体内培养3月后形成骨样组织。结论 BMSCs在大量扩增的同时，在一定条件下能向成骨细胞分化，细胞与藻酸钙复合物能在具免疫力的哺乳动物皮下形成骨样组织。BMSCs可作为骨组织工程较理想的种子细胞。     

兔骨髓基质细胞向成骨细胞分化过程的超微形态结构观察

目的观察并探讨骨髓基质细胞向成骨细胞诱导分化过程中细胞超微形态结构的变化及相互联系。方法抽取成年兔髂骨骨髓，分离、培养骨髓基质细胞，1周后分别采用含诱导因子的条件培养液和不含诱导因子的标准培养液继续培养，2周后收集细胞，应用透射电镜观察其超微结构；同时分别将上述两组细胞与煅烧骨体外复合并在原培养液中继续培养，分别于复合1、7、14d取出，用扫描电镜观察细胞表面超微形态。结果透射电镜下见诱导前的骨髓基质细胞浆少，核大，细胞器不发达，处于早期幼稚阶段，而诱导2周后的细胞核小、胞浆多，细胞器丰富，处于较为成熟阶段。扫描电镜下见复合培养2周内诱导前后的骨髓基质细胞均由圆盘形向多角形、条带状相互融合、重叠生长，诱导2周后的骨髓基质细胞间可见大量胶原纤维等基质成分以及钙盐颗粒，而诱导前的细胞始终未见基质分泌及钙盐颗粒。结论成骨诱导后，骨髓基质细胞内细胞器等超微结构极为丰富，细胞表面及细胞间有大量细胞外基质分泌和钙盐沉积。透射电镜和扫描电镜可动态观察骨髓基质细胞向成骨细胞分化过程中细胞超微形态结构的变化。     

葛根素和淫羊藿甙对成骨细胞生物学作用的比较研究

目的 对比葛根素和淫羊藿甙对成骨细胞增殖和分化的影响。方法 将小鼠骨髓基质干细胞定向诱导分化为成骨细胞，取第3、4代细胞，以rhBMP-2为阳性对照，MTT法观察葛根素和淫羊藿甙对成骨细胞的增殖作用，碱性磷酸酶（ALP）比活性测定及钙结节计数观察葛根素和淫羊藿甙对成骨细胞分化的影响。结果 20μg／ml的淫羊藿甙可显著促进成骨细胞的增殖；20μg／ml淫羊藿甙及50μg／ml葛根素均能提高成骨细胞的碱性磷酸酶活性，并使矿化结节的形成明显增多。结论 淫羊藿甙不仅能促进成骨细胞的分化，还能增强其增殖能力，而葛根素主要是通过刺激分化来增强成骨细胞的活力。     

转染特异性报导基因成骨细胞生物学性状及其与骨支架材料生物相容性的研究

目的研究转染特异性报导基因成骨细胞的生物学性状，并观察该细胞在骨支架材料上的生长特性和黏附性。方法常规复苏培养转染12×SBE—OC—Luc报导基因的前成骨细胞株OCTl细胞，通过倒置相差显微镜、HE染色、I型胶原免疫组化法染色、碱性磷酸酶（ALP）偶氮偶联法染色、矿化结节茜素红法染色及四环素法染色观察该转基因成骨细胞的生物学性状；并将其与纳米磷酸钙复合骨支架进行体外复合培养，通过扫描电镜观察该转基因成骨细胞在骨支架材料上的生长特性和黏附性。结果转染12×SBE—OC—Luc报导基因的前成骨细胞株OCTl细胞经培养后能贴壁生长，形态和成纤维细胞相似，能分泌胶原基质和ALP，经I型胶原免疫组化法染色及ALP偶氮偶联法染色呈强阳性；并能够形成矿化结节，茜素红法染色及四环素法染色呈阳性；该转基因成骨细胞在骨支架材料上具有良好的生长特性和黏附性，并能正常分化、增殖和成熟，分泌大量胶原基质和钙结节。结论转染12×SBE—OC—Luc报导基因后成骨细胞生物学性状未发生改变，其与骨支架材料亦具有良好的生物相容性。     

用多次酶消化法体外培养的大鼠成骨细胞及其鉴定

目的 针对目前体外培养成骨细胞方法的不足,建立一种理想的原代培养成骨细胞的方法,为骨替代材料的研究提供成骨细胞.方法 本实验用新生1～2天大鼠颅盖骨,采用多次酶消化法进行细胞体外培养.倒置显微镜观察细胞形态,并对其碱性磷酸酶（ALP）活性及矿化能力进行鉴定.结果 所培养细胞具有成骨细胞的形态学特征及体内成骨细胞的生物学行为.结论 本实验体外培养成骨细胞的方法切实可行,可为骨替代材料的研究提供种子细胞,也可为骨细胞生物学和骨组织工程的研究提供一种客观而有效的实验手段.     

左旋肉毒碱对人成骨细胞增殖和凋亡的影响

目的观察左旋肉毒碱(L-carnitine,L-C)对人成骨细胞增殖和凋亡的作用。方法以3H掺入法(3H-TdR)测定左旋肉毒碱对人成骨细胞增殖的影响;以吖啶橙/溴化乙啶染色和细胞凋亡ELISA(酶联免疫吸附法)试剂盒测定左旋肉毒碱对人成骨细胞凋亡的影响;以免疫印记法检测左旋肉毒碱干预前后活化型Caspase-3、-9蛋白质表达水平的改变。结果10~100mmol/L左旋肉毒碱能促进人成骨细胞增殖。吖啶橙/溴乙啶染色法示100mmol/L左旋肉毒碱干预使人成骨细胞凋亡细胞明显减少。ELISA结果示10~100mmol/L左旋肉毒碱干预可显著抑制人成骨细胞凋亡。10~100mmol/L左旋肉毒碱干预可抑制无血清饥饿诱导的人成骨细胞caspase-3、9活化增加。结论左旋肉毒碱促进人成骨细胞增殖,并通过下调Caspase-3、-9的活化抑制人成骨细胞凋亡。     

不同频率振动应变对成骨细胞增殖及分化能力的影响

目的 观察不同频率振动应变(vibration strain)对体外培养成骨细胞细胞周期、增殖能力及分化的影响,确定最佳振动频率.方法 应用自制复合振动仪,将振动强度0.5g(g为加速度),不同频段3～10、15～30、25～45、50～80和80～100Hz振动应变分别作用于成骨细胞,振动应变加载后分别检测细胞周期、细胞增殖能力(MTT法)及碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性的变化.结果 15～30和25～45Hz频段诱导成骨细胞周期循环(P<0.01),促进细胞增殖(P<0.01),增强ALP活性(P<0.01);80～100和3～10Hz频段抑制细胞周期循环(P<0.01);80～100Hz频段抑制细胞增殖(P<0.01);50～80和80～100Hz频段抑制ALP活性(P<0.01).结论 不同频率振动应变对成骨细胞周期、增殖能力、ALP活性均有影响,振动应变促进成骨细胞增殖及分化的最佳频率为15～45Hz.     

虾青素对成骨细胞羟自由基氧化损伤的影响

目的：在H2O2胁迫下，研究虾青素增强成骨细胞抗自由基损伤的作用。方法：用H2O2作用MC3T3-E1成骨细胞，建立自由基损伤细胞模型。培养的成骨细胞分为对照组、模型组、虾青素低剂量组（1×10^-7mol／L）、虾青素中剂量组（1×10^-6mol／L）和虾青素高剂量组（1×10^-5mol／L）。测定不同处理组细胞活力、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性、活性自由氧（reactive oxygen species，ROS）含量、脂质过氧化物（lipid oxygen，IJP0）含量，同时利用荧光偏振法测定细胞膜流动性。结果：模型组细胞活力、SOD活性、细胞膜流动性均比各剂量虾青素组显著降低（P〈0．01），而ROS、LPO含量均比各剂量虾青素组显著升高（P〈0．01）。结论：H2O2摄入会导致大鼠成骨细胞的氧化损伤，而虾青素可以预防或降低此类损伤对细胞的影响。     

甘肃产华中五味子对成骨细胞成骨能力的影响

目的 探讨甘肃产华中五味子对大鼠成骨细胞增殖与分化的影响.方法 采用血清药理学方法 ,对体外培养的大鼠成骨细胞以MTT法进行细胞增殖测定、以PNPP法测定碱性磷酸酶(ALP)活性、以茜素红染色进行矿化结节计数.结果 培养48 h的10%、15%和培养72 h的5%、10%华中五味子75%醇提取物血清组的细胞增殖速度较对照组快(P<0.05或P<0.01):培养48 h的10%、15%和培养72 h的10%华中五味子75%醇提取物血清组的ALP活性较对照组增加(P<0.05);培养2周的矿化结节计数显示,10%华中五味子75%醇提取物血清组多于对照组(P<0.01).结论 甘肃产华中五味子75%醇提取物对体外大鼠成骨细胞的增殖和分化具有促进作用.