MAPK—ERK在牙本质基质蛋白1信号通路中的作用

目的 探讨在人骨髓间充质干细胞（hMSC）、小鼠前成骨细胞（MC3T3）和成牙本质细胞（MDPC-23）中,牙本质基质蛋白1（DMP1）是否通过激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）-细胞外调节蛋白激酶（ERK）信号通路发挥作用.方法 Western blot 检测不同时间点rDMP1C 和rDMP1F 蛋白处理hMSC、MC3T3-E1 和MDPC-23 后,对MAPK-ERK 的激活情况;并检测使用MAPK 抑制剂后,ERK 的激活是否被抑制;细胞免疫荧光技术观察MAPK 抑制剂抑制激活的ERK 从胞浆向胞核的转位情况.Western blot 检测siRNA 沉默Ras 基因后,对rDMP1 引起MAPK-ERK 信号通路激活的影响.结果 三种细胞中,rDMP1F 和rDMP1C 在5 min ～ 3 h 均可以激活MAPK-ERK 通路,而总ERK 在各时间点均无显著变化;rDMP1F 激活信号通路的持续时间均明显长于rDMP1C;MAPK 抑制剂处理组的p-ERK 条带与rDMP1F/C 处理组的p-ERK 条带差别明显.hMSC 中,rDMP1F 激活MAPK 信号通路持续时间要长于其在MC3T3 和MDPC-23 中的作用.细胞免疫荧光检测发现,MAPK 抑制剂组可以阻断ERK 向细胞核内的转位.MC3T3 和MDPC-23 在siRNA 沉默Ras 基因后,ERK 的磷酸化水平与rDMP1F 单独处理组相比显著降低.结论 rDMP1C 和rDMP1F 都通过Ras 激活MAPK-ERK信号通路,而rDMP1F 比rDMP1C 具有更强的信号功能.     

mTOR信号通路与自身免疫性疾病研究进展

自身免疫性疾病是指由机体自身产生抗体或致敏淋巴细胞破坏、损伤自身组织和细胞成分,导致组织损害和器官功能障碍的原发性免疫性疾病.免疫耐受性的终止和破坏是其发病的根本机制.自噬是高度保守的依赖于溶酶体的自身物质降解过程.大量的免疫学过程高度依赖细胞自噬,包括病原体的识别和破坏、抗原呈递、淋巴细胞发育和功能以及炎症的调节等[1].目前发现对于自噬的调控主要是对mTOR和Beclin1 两大核心分子调控.mTOR可整合细胞外营养、能量及生长因子等多种信号,与基因转录、蛋白质翻译、核糖体合成等生物过程相关联,是细胞自噬的关键调节位点.因此,阐明mTOR信号通路与自身免疫性疾病的关系具有一定的理论和实际意义.     

心钠素对大鼠肝星状细胞活化过程中TGF-β1/Smads信号通路的影响

目的 探讨心钠素(ANP)对大鼠肝星状细胞(HSC T6)活化过程中TGF-β1/Smads信号通路的影响.方法 待HSC T6细胞贴壁后,在细胞培养瓶中加入ANP 10μmol/L培养1h,采用免疫荧光法、利用激光共聚焦显微镜观察细胞内Smad4和pSmad2/3蛋白细胞内转位.将HSC T6细胞分成空白未活化组、空白活化组、ANP1 μmoL/L组、ANP 10 μmol/L组,继续培养1h,分别提取细胞质蛋白及核蛋白,以Western blotting法检测Smad4蛋白表达水平变化.ANP作用24 h,收集细胞培养液,以ELISA法检测Ⅰ型胶原、MMP-13分泌量.结果 空白未活化组、ANP 10 μmol/L组Smad4、pSmad2/3在胞质内表达,空白活化组在核内表达;ANP1、10 μmol/L组细胞质内Smad4蛋白表达量较空白活化组增多(P均＜0.05),并随ANP浓度的增大表达增强(P＜0.05),而细胞核内Smad4蛋白表达量变化趋势与细胞质蛋白相反(P均＜0.05).ANP作用HSC T6 24 h后,细胞上清液中Ⅰ型胶原的分泌量较空白对照组减少(P＜0.05),MMP-13分泌量无明显变化.结论 ANP可在一定程度上阻断大鼠HSC T6细胞活化过程中TGF-β1/Smads信号通路的传导,减少了Ⅰ型胶原的分泌量,起到了抗肝纤维化的作用.     

Notch1信号通路在人脑胶质瘤U87细胞增殖、凋亡中的作用及机制探讨

目的 观察Notch1信号通路在人脑胶质瘤U87细胞增殖和凋亡中的作用,并探讨其机制.方法 将U87细胞随机分为A、B、C组,分别加入Notch信号激活剂rhNF-κB、抑制剂DAPT及PBS共培养48 h.用MTT法检测细胞吸光度值(A值)观察细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡率,RT-PCR、Western blot法分别检测U87细胞中的Notch1、Hes1、Bcl-2 mRNA及其蛋白.结果 培养24、48、72、96 h,A组细胞A值分别为0.185±0.007、0.398±0.012、0.735±0.015、1.083±0.031,B组分别为0.102±0.003、0.130±0.004、0.161±0.006、0.194±0.003,C组分别为0.167±0.005、0.265±0.008、0.496±0.011、0.737±0.016,A、B组与C组比较,P均＜0.05.A、B、C组细胞凋亡率分为0.96％±0.17％、26.51％±3.74％、8.76％±1.40％,A、B组与C组比较,P均＜0.05.与C组比较,A组细胞中Notch1、Hes1、Bcl-2 mRNA及其蛋白表达量均显著增加(P均＜0.05),B组细胞中Notch1、Hes1、Bcl-2 mRNA及其蛋白表达量均显著降低(P均＜0.05).结论 Notch1信号通路在人脑胶质瘤U87细胞增殖、凋亡中发挥了重要的调控作用,其机制可能与调节靶基因Hes1、抗凋亡蛋白Bcl-2表达有关.     

高糖对小鼠足细胞表型转化的诱导作用及机制探讨

目的观察高糖对小鼠足细胞表型转化的诱导作用,并探讨其机制。方法将传代培养后的小鼠足细胞随机分为A、B、C三组,A组常规培养,B组加入终浓度为30 mmol/L的葡萄糖、C组加入终浓度为30 mmol/L的葡萄糖及10μmol/L的蛋白质酪氨酸激酶(JAK2)特异性阻断剂α-氰-(3,4-二羟基)-N-苄基肉桂酰胺(AG490)进行培养,48 h后收集细胞,采用Western blot法检测足细胞中自身标志物人肾病蛋白(Nephrin)、间充质细胞标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及磷酸化蛋白质酪氨酸激酶(p-JAK2)蛋白,采用RT-PCR检测足细胞中的Nephrin、α-SMA mRNA。结果 A组足细胞中Nephrin、α-SMA、p-JAK2蛋白积分光密度值分别为0.96±0.01、0.21±0.02、0.39±0.01,B组分别为0.58±0.01、0.66±0.07、0.71±0.02,C组分别为0.87±0.04、0.35±0.02、0.41±0.04;A组足细胞中Nephrin、α-SMA mRNA的相对表达量为1.53±0.04、0.57±0.01,B组分别为0.82±0.09、0.89±0.03,C组分别为1.30±0.04、0.78±0.03。B组与A组比较,P均<0.05;C组与B组比较,P均<0.05。结论高糖可通过激活JAK/STAT信号途径诱导足细胞发生表型转化。     

化瘀祛痰方药及其拆方对内皮细胞TLR4/NF-kB炎症信号通路干预的研究

目的 探讨化瘀祛痰方药及其拆方含药血清对脂多糖(LPS)诱导人脐静脉内皮细胞EA.hy926 TLR4/NF-kB信号通路活化的干预作用.方法 40只SD大鼠随机分为5组,即空白对照组、全方组、补气组、化瘀组、祛痰组,各组大鼠分别以生理盐水和相应中药煎剂连续灌胃9d,末次灌胃给药2h后,腹主动脉采血,离心后分离血清.体外培养EA.hy926细胞,随机分为7组,即①正常对照组、②LPS刺激组、③全方组、④补气组、⑤化瘀组、⑥祛痰组、⑦空白血清对照组.其中②组加入终浓度为10μg/ml的LPS,③～⑦组用各组含药血清(浓度为10％)预处理24 h后加入终浓度为10 μg/ml的LPS,各组细胞培养24 h后进行各项指标测定.采用实时定量反转录-聚合酶链反应(Real-time PCR)定量分析TLR4、NF-kB和TNF-α mRNA表达;ELISA法检测TNF-α含量;Western印迹检测TLR4、NF-kB蛋白表达.结果 与正常对照组相比,LPS刺激后TLR4、NF-kB和TNF-α表达显著增加(P＜0.01),全方组TLR4、NF-kB和TNF-α的表达与刺激组相比显著减少(P＜0.01);拆方各组中,化瘀组TLR4、NF-kB和TNF-α水平均显著减少(P＜0.01),而补气组和祛痰组TLR4、NF-kB和TNF-α水平降低不明显.结论 化瘀祛痰方药及化瘀拆方可显著抑制内皮细胞TLR4/NF-kB炎症信号通路的活化,这可能是其抗AS的作用机制之一.     

组织工程血管移植在血液透析通路中的应用

目的:探讨组织工程血管移植应用于血液透析(HD)通路的可行性。方法:广泛查阅近期有关组织工程血管应用于HD通路的文献,对其动物模型及临床研究进行总结评价。结果:分层构建法可获得具有足够机械强度的组织工程血管。此后出现的简化分层构建组织工程血管在一系列动物模型及临床实验中被证明可用于动静脉通路的建立。近期一种生物反应器构建组织工程血管在狒狒模型上进行动静脉搭桥试验也获得成功,有望成为较理想的动静脉内瘘移植血管。结论:组织工程血管移植应用于HD通路是可行的,值得进一步研究。     

丹参对大鼠肝缺血再灌注损伤PI3K-AKT信号传导通路的影响

目的研究丹参注射液预处理对大鼠肝缺血再灌注损伤(HIRI)中PI3K-AKT信号传导通路的影响。方法健康雄性SD大鼠80只,随机分为4组,即假手术组、缺血再灌注组(IR组)、丹参组(SI组)、丹参+阻断剂组(LY组),每组分别按再灌注时间(1、3、6、24 h)分为4个时相,每组各个时相均为5只。制作70%肝缺血再灌注模型,测血清ALT、AST及LDH水平;免疫印迹法测肝组织中PI3K、Akt及p-Akt(Ser308)蛋白的表达情况;TUNEL法观察各组的肝细胞凋亡;以及光镜下观察大鼠肝脏形态学变化。结果 ALT、AST、LDH含量:IR、SI、LY组的值明显高于假手术组(P<0.05);SI组、LY组各个时相的值较IR组均下降(P<0.05);与LY组比较,SI组各个时相的值均下降(P<0.05)。免疫印迹检测:各组PI3K、AKT的表达无显著差异(P>0.05);而在p-Akt的表达中,假手术、IR、LY组组间无显著差异(P>0.05),SI组各时相的表达都高于其余各组,且均有显著差异(P<0.05)。凋亡检测:IR组肝细胞有典型的凋亡特征,SI、LY及假手术组均优于IR组(P<0.05);其中SI组又优于LY组(P<0.05);假手术组正常,优于其余各组。在光镜下观察肝形态学变化,可见IR组损伤最为明显,SI组和LY组较IR组轻,其中SI组更轻,而假手术组肝组织形态正常。结论肝脏缺血再灌注造成了肝细胞显著损伤,丹参注射液预处理通过PI3K-Akt信号传导通路的调控发挥了对肝脏的保护作用。     

替米沙坦通过JAK/STAT通路对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用

目的探讨JAK-STAT通路的主要成员STAT1和STAT3在心肌缺血再灌注(I/R)损伤过程中激活的功能作用及AT1受体拮抗剂替米沙坦抗心肌I/R损伤的受体后机制。方法采用Langendorff离体心肌I/R模型,65只雄性Wistar大鼠分为5组,每组13只:正常对照组、I/R组、AG490组、替米沙坦预处理组、替米沙坦后处理组。动态监测LVDP和dp/dtmax;免疫印迹法检测p-STAT1,p-STAT3的蛋白表达;TTC染色计算心肌梗死面积;TUNNEL法检测心肌细胞凋亡指数(AI),RT-PCR法检测Bcl-2、Bax的mRNA表达。结果与I/R组比,JAK阻断剂AG490、替米沙坦预处理及后处理均能缩小心肌梗死面积(P<0.01),降低心肌细胞AI(P<0.01),改善心功能,使LVDP和dp/dtmax均明显升高(P<0.01),而使p-STAT1和p-STAT3的蛋白表达明显减少(P<0.01和P<0.05),以p-STAT1表达降低更为明显,p-STAT1与p-STAT3比值下调,Bax mRNA表达显著减少(P<0.01),而Bcl-2 mRNA表达增多(P<0.05)。结论替米沙坦具有抗心肌I/R损伤作用,其机制与阻断JAK-STAT通路,下调促凋亡基因Bax,上调抑制凋亡基因Bcl-2有关。     

Frat1与β-catenin在非小细胞肺癌中表达的相关性及意义

目的探讨Frat1在肺癌组织中的表达情况以及Frat1与β-catenin在肺癌组织中表达的相关性。方法用免疫组化SP法对115例原发性非小细胞肺癌(NSCLC)患者手术标本中Frat1和β-catenin的表达进行检测,使用SPSS16.0统计软件进行分析。结果在NSCLC中,Frat1的表达与肺癌组织的低分化(P=0.035)、淋巴结转移(P=0.019)、TNM分期相关(P=0.010);β-catenin的表达与肺癌组织的低分化(P=0.017)、淋巴结转移(P=0.007)、TNM分期相关(P=0.016);Frat1的表达与β-catenin的表达有相关性(P=0.003)。结论 Frat1和β-catenin与肺癌的低分化、转移、高级别TNM分期等恶性表型有关,二者在肺癌组织中的表达有相关性,Frat1可能成为NSCLC患者靶向治疗的新靶点。