中国版纳猪MHCI类P1分子全长的原核表达与纯化

目的：获得原核表达的中国版纳猪ＳＬＡＩ类Ｐ１蛋白质分子。方法：ＰＣＲ扩增去信号肽的ＳＬＡＩ类Ｐ１ｃＤＮＡ序列，亚克隆至ｐＧＥＭＴ载体，测序。将亚克隆的Ｐ１　ｃＤＮＡ片段插入表达载体ｐＥＴ４２ｂ（＋），构建重组表达质粒ｐＥＴ－４２ｂ（＋）／ｓｌａ－ｐｌ，转化Ｅ·ｃｏｌｉ表达菌 ＢＬ２１－ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）－ＲＩＬ，ＩＰＴＧ诱导 Ｐ１－８ ｘ ｈｉｓ融合蛋白表达，经包涵体洗涤，８ ｍｏｌ／Ｌ尿素变性溶解，Ｎｉ２＋亲和层析，梯度透析后，定量保存。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ鉴定目的蛋白的表达与纯化。结果：目的蛋白（分子量３９．５ ｋＤ）表达量占细菌总蛋白 １５％，每升表达菌获得纯度９５％的目的蛋白 ４０ ｍｇ～６０ｍｇ。结论：成功建立猪 ＳＬＡ分子全长原核表达、纯化体系，为建立间接识别猪移植抗原ＳＬＡＩ类分子的人Ｔ细胞系及表位分析打下基础。     

脑膜炎大肠埃希菌侵袭素IbeA结合多肽的初步研究

目的脑膜炎大肠埃希菌（E．coli）侵袭素IbeA通过与脑微血管内皮细胞表面受体结合，从而介导细菌穿透血脑屏障引起新生儿细菌性脑膜炎。为通过肽库筛选获得与IbeA蛋白结合的多肽，建立噬菌体随机肽库筛选IbeA结合多肽模体的方法。方法首先制备靶分子，用PCR扩增出全长ibeA基因序列，克隆至表达载体pET28a中，转化大肠埃希菌BL21（DE3）．经IPTG诱导表达出带有His-tag的目的蛋白，经变性复性后通过Ni^2＋-NTA亲和层析柱得到纯度达90％的重组蛋白。然后以固相化IbeA重组蛋白为靶亲和筛选噬菌体线性12肽库。结果经过3轮淘选，得到能和IbeA结合的24个重组噬菌体克隆；挑选15个亲和力高的克隆进行DNA测序，对比分析所得的短肽序列。固相Fmoc法合成短肽，并进行结合实验、阻断实验和竞争抑制实验。绪论以重组表达的IbeA融合蛋白为靶筛选得到的重组噬菌体十二肽克隆，能够和IbeA蛋白结合，为IbeA蛋白结合多肽。结果提示所筛选的阳性噬菌体克隆及其合成肽可能模拟IbeA受体表位的结构。     

大肠杆菌胞内的共表达策略

大肠杆菌表达系统因其具有系统工具成熟、表达水平高、易于操作和成本低廉等优点而成为表达外源蛋白最常用的表达系统之一。但该系统在表达外源蛋白，尤其是真核蛋白时也存在不少缺陷，其中最主要的是由于大肠杆菌胞内缺乏帮助蛋白正确折叠的机制，所以相当一部分在大肠杆菌中表达的外源蛋白都聚集成沉淀，即以包涵体的形式存在，从而丧失了生物活性。因此，获得可溶蛋白成为在大肠杆菌系统表达外源蛋白的优选方案之一。目前较常用的办法是融合表达，即将融合伴体和目标蛋白连接成为一个融合蛋白进行表达。因为融合伴体通常是来源于大肠杆菌自身的蛋白，且具有分子伴侣的功能，因此，融合表达不仅可以提高蛋白表达量，还可以帮助目标蛋白正确折叠，从而获得可溶蛋白。     

发病前细菌感染抑制过敏性哮喘发作的实验研究

目的： 研究发病前细菌感染对过敏性哮喘发病的影响。 方法： 用豚鼠作动物模型，观察金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌、肺炎双球菌等4种呼吸道常见细菌感染之后哮喘发作时肺泡灌洗液中的白细胞总数、酸性粒细胞总数和百分比以及肺部的病理变化。 结果： 各细菌感染组肺泡灌洗液(BALF)中的白细胞总数均明显低于对照组，金黄色葡萄球菌组和大肠杆菌组酸性粒细胞总数和百分比明显降低，病理结果表明各细菌感染组的病变程度都要明显轻于对照组。 结论： 部分细菌感染后能够抑制哮喘的发作。     

EHEC O157:H7志贺毒素Ⅱ型A、B亚单位的表达及功能鉴定

目的 克隆、表达肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)O157:H7志贺毒素(Shiga toxin,Stx)Ⅱ型A、B亚单位,并鉴定其免疫学功能.方法 从EHECO157:H7基因组中克隆编码Stx Ⅱ型A、B亚单位的基因,经测序、酶切后,导入表达载体pGEX-4T-2,转化大肠杆菌Topl0F',经诱导、纯化得到谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)-A和GST-B融合蛋白.分别用A、B亚单位融合蛋白免疫BALB/c小鼠获得高免血清,观察A、B亚单位血清对小鼠进行毒素攻击的保护作用.结果 Stx Ⅱ型A、B亚单位的GST融合蛋白获得高效表达并纯化;A、B亚单位的高免血清可以保护小鼠对致死量毒素的攻击.结论 Stx Ⅱ型A、B亚单位蛋白可以作为EHEC O157:H7疫苗的候选分子,同时针对A、B亚单位蛋白的中和单抗可以对易感人群起到紧急保护作用.     

hEGF和hbFGF的C端(78-154aa)融合蛋白的表达、纯化及活性测定

目的:将人表皮生长因子(hEGF)与人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF)的C端连接,构建出既可与肝素结合,又具有促进细胞生长活性的融合蛋白,并在大肠杆菌中高效表达。方法:将PCR扩增hEGF全基因与PCR扩增hbFGF5端的231bp的片段连接,克隆到表达载体pJN,构建出含融合基因的表达质粒pJRH。将pJRH转化BL21(DE3)表达菌株,获得融合蛋白的表达菌株pJRH(BL)。Westernblot检测表达产物免疫学活性。表达产物上肝素亲和柱和分子筛进行纯化。结果:融合蛋白表达产量为30%,融合蛋白不仅能与肝素结合,而且具有促细胞增殖的活性。Westernblot检测结果显示融合蛋白有EGF的免疫活性。融合蛋白的等电点为5.2。结论:本研究构建了一个hEGF和hbFGF的C端的融合蛋白,该蛋白基本保持了两者原有的生物活性。作为一个新的活性因子,本研究为探讨活性因子蛋白结构与功能的关系奠定基础。     

抗人结肠癌单抗MC5的功能性ScFv在大肠杆菌中的可溶性表达

目的：制备抗人结肠癌单抗MC5的具功能活性的可溶性单链可变区片段（ScFv）。方法：从分泌MC5的杂交瘤细胞分离mRNA，RT-PCR分别扩增抗体质量、轻链可变区基因（VH和VLDNA），经linkerDNA连接形成ScFvDNA。将ScFvDNA与噬粒载体pCANTAB5E的连接产物转化于大肠杆菌TG1，转化菌经辅助噬菌体M13KO7感染后，获得重组噬菌体。以高表达MC5结合抗原的人结肠癌细胞系SW480对重组噬菌体进行2轮筛选后，经ELISA筛选呈现抗体ScFv片段的噬菌体单克隆。取2个强阳性克隆的噬菌体感染大肠杆菌HB2151，用于表达可溶性ScFv。经点印迹和Western印迹对可溶性ScFv进行鉴定，经ELISA检测可溶性ScFv的抗原结合活性。结果：所获得的VH、VL和ScFvDNA分别约为340、320和750bp。对重组哓菌体经2轮亲和筛选后，经ELISA从25个克隆中筛检出10个抗原阳性克隆。源于2个强阳性克隆的可溶性ScFv的分子质量为32000u，且浓集于细菌周质腔中，可溶性ScFv具有抗原结合活性，其结合位点与亲本单抗MC5相同。结论：针对MC5的具功能活性的可溶性ScFv的成功制备，为人结肠癌的体外（乃至体内）研究提供了新的靶向载体分子。     

Expression of Cytochrome P450nor in Escherichia coli , Purification and Preparation of Polyclonal Antibodies

The term “cytochrome P450” was characterized of aunique 450 nm optical absorption peak of its carbon mon oxide bound form. Cytochrome P450s constitute a super gene family of heme containing proteins that are involvedin the metabolism of a variety o…     

复方戊二醛消毒清洁剂试验室效果观察

复方戊二醛消毒清洁剂当其浓度为100mg/L时,作用10min,对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的平均杀灭率分别为99.99％和99.98％;当其浓度为200mg/L时,分别作用3min、5min、10min,对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌的平均杀灭率分别为99.96％和99.98％、99.99％。在50％有机物存在下,复方戊二醛消毒清洁剂对大肠杆菌的杀灭效果有轻度影响。当其浓度为9546mg/L时,作用180min可将HBsAg抗原性破坏,该消毒剂经54℃,放置14天后,戊二醛含量下降3.77％,其有效期可为1年。