胃癌单抗MGd1的噬菌体呈现型ScFv的制备

目的 制备胃癌单抗MGd1的单链可变区片段（single chain variable fragment,ScFv),为胃癌体内诊疗研究提供候选靶向载体分子。方法 从MGd1杂交瘤分离mRNA,RT-PCR分别扩增抗体重、轻链可变区基因（VH和VLDNA）,二者经linkerDNA连接形成ScFvDNA,将ScFvDNA与载体pCANTAB5E的连接产物转化于大肠杆菌TG1,经M13KO7感染后,获得重组噬菌体抗体ScFv,以高表达MGd1结合抗原的细胞株KATOⅢ对重组噬菌体抗体ScFv进行峡谷轮筛选后;随机挑取克隆经ELISA筛选MGd1ScFv单克隆,并对其结合抗原的能力进行鉴定。结果 VH、VL和ScFvDNA分别约为340、320和750bp,经两轮亲和筛选后,在随机筛检的30个克隆中得到12个噬菌体呈现型MGd1ScFv单克隆,其中结合抗原能力强的克隆有5个。结论 用噬菌体呈现技术成功地获得了单抗MGd1的ScFv,为拓展该抗体的应用范围奠定了基础。     

噬菌体抗体库技术筛选结肠癌单抗MC3的抗独特型抗体

目的：获得结肠癌单抗MC3的噬菌体呈现型抗独特型抗体（anti-Id）。方法：分离经单抗免疫鼠脾脏的mRNA,经RT－PCR分别扩增抗体VH和VLDNA,进而连接形成ScFv DNA。将ScFv DNA与载体pCANTAB5E的连接产物转化于大肠杆菌TG1,经M13KO7挽救后获得噬菌体呈现型ScFv文库。以MC3对文库进行四轮筛选后,随机挑取克生经ELISA筛选呈现anti-Id ScFv的噬菌体克隆。结果：VH、VL和ScFv DNA分别约为340、320和750bp。抗体ScFv文库经四轮筛选后,在随机筛检的50个克隆中得到15个呈现antii-Id ScFv的菌体单克隆。结论：用噬菌体抗体库技术成功地获得了单抗MC3的anti-Id ScFv,从而为进行结肠癌重组anti-Id疫苗作用的研究提供了候选分子。     

乙肝病毒核心蛋白人源单链抗体在大肠杆菌中的表达

目的 获得可溶性的抗乙型肝炎病毒（HBV）核心蛋白（core)的人源单链可变区抗体（ScFv)，为得到纯度高、活力强的HBc-ScFv和进一步的抗HBV治疗奠定基础。方法 采用噬菌体表面展示技术，以重组的HBV核心蛋白为包被抗原，从噬菌体单链可变区抗体库中经过5轮“吸附－洗脱－扩增”筛选过程，获得抗原结合活性较强的乙型肝炎核心蛋白人源单链可变区抗体ScFv片段克隆，并对其进行DNA序列及免疫活性测定。从噬菌体抗体阳性克隆中提取质粒转化大肠杆菌HB2151，IPTG诱导表达乙型肝炎核心蛋白可溶性人源单链可变区抗体，ELISA和western blot检测其抗原结合特异性。结果 克隆了乙型肝炎核心蛋白的单链可变区抗体基因；经DNA酶切和序列分析表明，该抗体基因由771个碱基组成；ELISA和western blot结果表明：在大肠杆菌HB2151中经IPTG诱导表达的可溶性乙型肝炎核心蛋白的单链可变区抗体，具有结合乙型肝炎核心蛋白的特异性和免疫活性。结论 克隆、鉴定并在大肠杆菌HB2151中表达了可溶性的HBc-ScFv。     

针对单克隆抗体MGb1的重组抗独特型抗体的筛选与鉴定

目的 利用噬菌体呈现技术筛选针对抗胃癌单克隆抗体（简称单抗）MGb1的重组抗独特型抗体（抗-Id），为研制胃癌重组抗-Id瘤苗提供候选分子。方法 以单克隆抗体MGb1免疫Balb／c小鼠，取脾分离mRNA。RT-PCR分别扩增抗体VL和VH cDNA，经linker DNA连接形成ScFv DNA。将scFv DNA与载体pCANTAB5E的连接产物转化于大肠杆菌TG1，经M13KO7感染后，获得重组噬菌体抗体ScFv文库。以单抗MGb1对文库进行4轮淘选后，随机挑取克隆经ELISA筛选呈现抗-Id scFv的噬菌体单克隆，进而经竞争ELISA对其所属抗-Id类型进行初步鉴定。结果 VL和VH cDNA分别约为320和340bp，ScFv DNA约为750bp。抗体ScFv文库经四轮淘选后，在随机筛检的50个克隆中得到18个呈现抗-Id ScFv的噬菌体单克隆。在18个克隆中，有4个呈现β或γ型抗-Id ScFv。结论 经重组噬菌体抗体技术成功地筛选到了针对单抗MGb1的噬菌体呈现型抗-Id ScFv，从而为进一步获得能诱导抗胃癌免疫的抗-Id ScFv奠定了基础。     

抗阿尔茨海默病Aβ人源单链抗体基因的筛选和表达

目的 从人源噬菌体单链抗体库中筛选与阿尔茨海默病发病中起关键作用的β淀粉样多肽(Aβ)1-42特异性结合的单链可变区抗体(scFv)基因,利用原核生物大肠杆菌进行可溶性表达,以获得抗AB1-42人源抗体.方法 利用噬菌体展示技术对人源噬菌体单链抗体库进行多轮富集,以Aβ1-42为抗原经酶联免疫吸附(ELISA)检测,筛选与Aβ1-42特异性结合的阳性噬菌体克隆,再用阳性噬菌体感染E.coli HB2151进行可溶性表达,经SDS-PAGE、Western blot及ELISA法检测scFv单抗的可溶性表达水平及抗原结合活性.并对阳性scFv抗体基因进行基因测序鉴定.结果 获得了7个特异性的抗Aβ1-42 scFv阳性噬菌体克隆,其中4个克隆ELISA检测吸光度值(A值)高于阴性对照5倍以上;其中1株(A 10)获得可溶性单链抗体的成功表达,表达产物主要位于菌体中,ELISA效价显示在全菌蛋白中A值高于对照5倍以上.其相对分子质量约为33 000.DNA测序表明所获抗体的可变区基因属于scFv抗体基因,推导得到的氨基酸序列具有典型的抗体可变区结构.结论 用人源噬菌体单链抗体库筛选出抗Aβ1-42的人源抗体单链可变区基因,并成功表达了具有抗原结合活性的可溶性单链抗体,为进一步研究阿尔茨海默病的发病机制和治疗奠定了基础.     

抗vWF与GPIb-IX结合部位的噬菌体呈现型单链抗体制备及功能研究

目的：为了研制新型特异性抗血栓制剂。方法：利用噬菌体展示文库技术筛选与vWF-A1区有高亲合力单链抗体(ScFv)；基因重组的方法构建高效表达载体pET-20b( )-ScFv，在大肠杆菌中诱导表达；夹心ELISA方法鉴定此单抗的抗原结合活性；瑞斯脱霉素诱导的血小板聚集试验(RIPA)测定ScFv对血小板聚集的抑制作用。结果：噬菌体展示技术筛选的ScFv在大肠杆菌中成功地诱导表达，表达的ScFv占菌体总蛋白的41％，以包涵体形式存在；经纯化复性的ScFv可以与。vWF、rvWF-A1、rvWF-A1/／A3结合，但不与rvWF-A3、BSA反应；ScFv具有抑制RIPA功能，抑制率为73．7％。结论：在大肠杆菌中高效表达的噬菌体展示技术筛选的抗vWF-A1区ScFv可特异性与vWF-A1区结合，而抑制瑞斯脱霉素诱导的血小板聚集，显示出很好的应用前景，为研制新型抗栓药物奠定基础。     

从半合成噬菌体抗体库中克隆抗地高辛人单链抗体

目的：从半合成噬菌体抗体库中克隆抗地高辛（Dig）人单链抗体（ADA ScFv），为Dig中毒的诊断和治疗提供人源性抗体。方法：①以改良法制备Dig-BSA偶联物②以固相化的Dig-BSA偶联物对人噬菌体ScFv抗体库进行了4轮筛选，通过ELISA筛选出能结合Dig的抗体克隆并鉴定其活性，通过ELIS竞争抑制实验分析其特异性，对阳性克隆的DNA进行测序分析。结果：①在对抗体库的筛选过程中可见有明显的富集；②获得一株可结合Dig及其类似物的阳性克隆；③阳性克隆的可变区分别属于VH5和Vλ1亚群。结论：利用噬菌体抗体库技术获得了能与Dig及其它洋地黄类药物结合的人ADA ScFv，经过一步分析及抗体工程改造后，有可能为临床上诊断及治疗洋地黄类药物中毒提供具有实用价值的人源性抗体。     

抗五步蛇毒ScFv噬菌体显示文库的构建及表达

目的 :构建抗五步蛇毒的特异性ScFv噬菌体显示文库 ,并从中筛选出阳性克隆。方法 :用五步蛇毒素免疫BALB C小鼠 ,挑选其中效价最高的 3只小鼠提取脾脏组织 ,抽提细胞总RNA ,经RT PCR分别扩增出VH、VL基因片段 ,经Linker连接成ScFv基因 (singlechainvariablefragment) ,再把ScFv基因重组到pCANTAB 5E载体 ,转化至大肠杆菌TG1中表达 ,经辅助噬菌体 (Helperphage)M13K0 7拯救后建成噬菌体显示文库。结果 :经 4轮吸附 洗脱 富集筛选后 ,库容量达到 4× 10 8cfu L ,随机挑取 90个克隆进行ELISA检测 ,结果 16个呈阳性 ,并进行了重复验证。结论 :成功构建出具有一定库容的特异性ScFv噬菌体展示库     

人源性抗HBc单链抗体的筛选、鉴定及基因序列测定

目的:筛选人源性抗乙型肝炎病毒核心蛋白(HBc)单链抗体(ScFv)并在体外原核表达、鉴定和基因序列测定, 为抗HBcScFv的进一步研究奠定基础。方法: 采用噬菌体表面展示技术, 以乙肝病毒核心抗原为包被抗原, 从人源性单链噬菌体抗体库中经过3轮"吸附-感染-扩增"的筛选过程, 获得抗原结合活性较强的人源性抗HBc单链抗体阳性克隆, 并在大肠杆菌HB2151中进行ScFv可溶性表达, 对其进行免疫学鉴定和序列测定。结果:筛选出的ScFv具有抗HBc的特异性, 并可在大肠杆菌中进行可溶性表达;基因序列测定表明, 该ScFv的重链段基因与人类免疫球蛋白重链可变区相符, 轻链段基因为人类免疫球蛋白κ轻链可变区。结论:利用噬菌体抗体库技术, 成功筛选出人源性抗HBcScFv并获得其基因序列。     

抗人肺癌单链抗体噬菌体库的构建及特异性单链抗体的鉴定

目的 构建人源噬菌体抗体库,并从中筛选出抗肺癌人源单链抗体。方法 提取肺癌患者癌旁淋巴结组织,通过RT-PCR扩增出重链可变区基因（VH）和轻链可变区基因（VL）,再经剪切-重叠-延伸PCR(SOE-PCR)将VH 和VL连接得到单链抗体（ScFv）。将双酶切后的ScFv基因片段克隆入噬菌体表达载体pCANTAB5E,得到初级噬菌体抗体库。以肺腺癌细胞株A549为抗原对抗体库进行4轮筛选富集,鉴定抗体库性能。将得到的阳性克隆用IPTG诱导表达并进行检测。结果 成功构建噬菌体单链抗体库。经筛选富集,噬菌体收获率得到增加,第4轮是第1轮的115倍。随机选取10个克隆,通过ELISA法检测到其中7个与A549细胞呈阳性反应,阳性率为70%。SDS-PAGE及ELISA检测证实得到人源抗肺癌单链抗体。结论 成功构建人源单链抗体噬菌体库,从中获得具有较高特异性的抗人肺癌单链抗体。     

抗菌肽MagaininⅡ单链抗体基因的构建及其表达

目的 将克隆的抗体轻重链可变区基因拼接成单链抗体基因并将其在大肠杆菌中表达。方法 通过ＲＴ－ＰＣＲ从两株抗ＭａｇａｉｎｉｎⅡ杂交瘤细胞株（２Ｄ１,３Ｆ８）中克隆出ＶＨ和ＶＬ基因,然后利用重组ＰＣＲ技术,将ＶＨ和ＶＬ基因通过柔性肽段（ＧＬＹ４Ｓｅｒ）３的Ｌｉｎｋｅｒ拼接成单链抗体基因（ＳｃＦｖ）,将ＳｃＦｖ克隆到表达载体ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ上并将其分别在大肠杆菌Ｅ．ｃｏｋｉ ＨＢ２１５１及ＴＧ１中进行     

抗人VEGF165单链抗体的构建与表达

为降低鼠源抗体对人体的免疫原性,构建表达了ＶｍＤ１１的单链抗体。方法用ｏｖｅｒｌａｐＰＣＲ构建出单链抗体的基因,克隆入表达载体ｐＫｐＬ－３ａ,在大直菌ｏｐｏ２１３６中表达,采用抗原结合ＥＬＩＳＡ和竞争抑制ＥＬＩＳＡ测定活性。结果经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测,诱导后的细菌表达了２６ｋＤ的蛋白;ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ证实该蛋白为表达的单链抗体。经变性,复性后,该单链抗体可特异结合人ＶＥＧＦ１６５抗原,并与Ｖ     

重链可变区基因随机CDR3ScFv噬菌体抗体库的构建及筛选

目的构建VH 基因随机CDR3ScFv噬菌体抗体库 ,并筛选抗HFRS病毒NP抗原的噬菌体抗体。方法采用随机引物PCR法扩增抗HFRS病毒mAb1A8的VH 基因 ,并与1A8VL 基因共同克隆入噬菌粒表达载体 pHEN1后 ,构建VH 基因随机CDR3ScFv基因库。继用辅噬菌体VCSM13超感染后得到噬菌体抗体库 ,然后用HFRS病毒抗原进行筛选。随机挑取筛选的菌落超感染 ,用夹心ELISA检测超感染上清。结果获得库容量约为107 噬菌体抗体库。夹心ELISA的结果表明 ,筛选出的噬菌体抗体可与HFRS病毒NP抗原特异性结合。结论成功地构建了库容量较高的ScFv噬菌体抗体库 ,并获得可与HFRS病毒NP抗原结合的噬菌体抗体。     

抗人纤维蛋白噬菌体单链抗体库的构建和鉴定

目的应用噬菌体展示技术构建抗人纤维蛋白单链抗体(scFv)文库,筛选高亲和力抗人纤维蛋白scFv并进行鉴定。方法利用人纤维蛋白免疫小鼠,分别扩增小鼠VH和VL基因,经重叠延伸聚合酶链反应(PCR)将VH和VL基因拼接成scFv基因,SfiⅠ/NotⅠ双酶切克隆入pCANTAB 5E噬菌粒载体,转化E.coli TG1构建成库,采用人纤维蛋白原对抗体库进行负筛选,人纤维蛋白进行正筛选,酶联免疫吸附分析(ELISA)检测阳性克隆的抗原特异性并进行测序分析。结果构建了库容为8.7×106的抗人纤维蛋白scFv库,ELISA测定显示scFv具有较高的抗原特异性;抗人纤维蛋白scFv基因序列长732 bp,编码244个氨基酸,VH和VL基因均有明确的3个互补决定区和4个骨架区。结论成功构建了抗人纤维蛋白scFv文库,并筛选到高亲和力的抗人纤维蛋白scFv,为新型血栓显像剂的开发奠定了实验基础。     

从人源全合成抗体库中筛选到抗人干扰素α1b单链抗体

目的研究开发人源抗huIFN—α的基因工程抗体,为系统性红斑狼疮（Systemic lupus erythematosus,SLE）的治疗提供有效的抗体药物。方法本研究利用噬菌体表面展示技术,以纯化的人干扰素α1b（huIFN-α1b）和人干扰素α2b（huIFN—α2b）蛋白为抗原从人源全合成抗体库中筛选抗huIFN-α的基因工程单链（single chain variable fragment,scFv）抗体,通过phage—ELISA对噬菌体单链抗体的结合特异性和稳定性进行验证。将单链抗体基因克隆到原核分泌表达载体pET22b上在大肠杆菌BL21（DE3）中表达,通过Western blot检测单链抗体的分泌表达,并通过ELISA对单链抗体的结合特异性进行验证。通过金属螯合亲和层析纯化单链抗体,并用Western Blot对单链抗体的结合特异性进行鉴定。结果经过3轮富集筛选,获得100株对huIFN—α1b有特异性结合的噬菌体单链抗体。对得到的86株克隆的测序分析表明,共有9株带有不同的抗体轻重链可变区序列及其组合的抗体,有7株抗体轻重链可变区序列分类在VH3和VL3家族,有2株抗体轻重链可变区序列分类在VH3和VL1家族。获得了5株稳定且特异针对huIFN—α1b而与huIFN-α2b和huIFN-γ无交叉反应的人源单抗。这5株抗体在BL21（DE3）中分泌表达,有3株单链抗体能特异性结合huIFN-α1b而与无关抗原无交叉反应。结论通过噬菌体表面展示技术,从人源全合成抗体库中筛选得到3株稳定且特异结合huIFN—α1b的人源治疗用基因工程单克隆抗体。