基于核糖核酸测序探讨马尔尼菲篮状菌感染致小鼠脑皮层损伤的机制

目的 应用核糖核酸测序(RNA-seq)技术探讨马尔尼菲篮状菌(TM)致小鼠脑皮层损伤的可能机制。方法 (1)将10只C57/BL6小鼠随机分为TM感染组和健康对照组(5只/组)后,分别经尾静脉注射TM分生孢子悬液、生理盐水。将BV2细胞和N2a细胞均随机分为TM感染组和空白对照组,TM感染组加入TM分生孢子悬液,空白对照组加入等量培养液。(2)建模成功后,取小鼠脑皮层组织进行RNA-seq后分析差异表达基因(DEGs);采用R 4.1.2软件对DEGs进行京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析和基因本体论(GO)功能富集分析等。取两组小鼠脑皮层组织及两组BV2细胞、N2a细胞,采用实时荧光定量PCR对富集通路相关DEGs、促炎因子进行体内体外验证。结果 (1)共获得871个DEGs,其中上调基因373个、下调基因498个。KEGG通路富集分析结果显示,显著性最大的通路为氧化磷酸化通路(Q=9.60×10^-3),基因数目比例最大的通路为神经退行性病变-多种疾病通路;GO功能富集分析结果显示,DEGs主要涉及细胞因子产生的正向调节、突触组织等生物学过程和组...     

单细胞转录组测序技术及其在肿瘤研究中的应用

单细胞转录组测序是指对单个细胞的全部RNA进行逆转录、扩增和测序,再进行生物信息学分析的技术。自2009年Tang等基于高通量测序平台开始单细胞转录组测序之后,该技术发展突飞猛进。由于该技术能在单细胞水平诠释细胞的异质性,因此已广泛应用于生命科学各领域尤其是肿瘤等疾病研究。本文将主要综述单细胞转录组测序技术流程和技术发展,及其在肿瘤异质性、肿瘤转移、肿瘤微环境、肿瘤药物等研究中的应用进展。     

缺血性脑卒中后小鼠脑组织中星形胶质细胞的异质性分析

目的：基于单细胞测序技术对缺血性脑卒中（ischemic stroke,IS）后脑组织中星形胶质细胞的动态变化进行研究,以更好地理解星形胶质细胞在IS发生发展中的作用。方法：利用GEO公共数据库下载IS小鼠脑组织测序数据（GSE227651）,通过tSNE聚类降维分析获取不同的星形胶质细胞亚群,并对IS后第1、3和7天缺血损伤脑组织中不同星形胶质细胞亚群的动态变化及功能进行分析;利用Monocle软件包对不同星形胶质细胞亚群所处的发育阶段进行分析;利用CellChat软件包对星形胶质细胞与其他细胞亚群之间的配受体相互作用情况进行动态分析。结果：小鼠脑组织细胞聚类为19个细胞亚群,注释为16种不同的细胞;对星形胶质细胞重新聚类分析,进一步分为6个星形胶质细胞亚群,根据功能分析将星形胶质细胞亚群2和亚群5定义为反应性星形胶质细胞,亚群0和亚群3定义为修复性星形胶质细胞,亚群1和亚群4为静息性星形胶质细胞。根据拟时序分析结果进一步将星形胶质细胞亚群2定义为急性反应性星形胶质细胞,亚群0定义为缺血损伤后修复性星形胶质细胞。细胞配受体相互作用分析显示,星形胶质细胞与星形胶质细胞、B细胞、NK细胞、内皮细胞、巨噬细胞、上皮细胞和神经元的配受体作用关系随时间动态改变。结论：星形胶质细胞的功能状态在IS后随时间动态改变,在IS后的早期主要通过急性反应性星形胶质细胞介导损伤后的急性炎症反应,而在IS后第3天开始通过缺血损伤后修复性星形胶质细胞参与损伤后脑组织的功能重建。     

致血流与腹腔共同感染大肠埃希菌表型和基因型特征分析

目的分析致血流与腹腔共同感染大肠埃希菌(CoECO)的表型和基因型特征, 为经验性抗感染治疗提供线索。方法回顾性分析2010至2020年解放军总医院第一医学中心检验科自血液和腹腔标本中分离出的大肠埃希菌菌株。使用质谱鉴定仪鉴定菌种。使用全自动细菌鉴定药敏仪测定最小抑菌浓度。采用2×150 bp双末端测序策略对大肠埃希菌进行高通量测序。基因组序列经拼接后, 使用kSNP3软件对菌株序列进行单核苷酸多态性(SNP)分析, 以明确菌株间的同源关系;若分离自两部位的菌株具有较高同源关系, 视为同一菌株, 则该病例为CoECO感染病例。使用PubMLST网站确定多位点序列型(MLST), 使用CARD网站筛选耐药基因。结果共筛选出70例CoECO感染病例, 其中男45例, 女25例, 年龄(59.2±16.3)岁。每例CoECO感染病例选取1株大肠埃希菌进行后续分析, 共计70株, 分属于35种ST型, 菌株数量较多的ST型包括:ST38(n=6)、ST405(n=6)、ST1193(n=6)、ST131(n=5), 其他ST型所含菌株均少于5株。菌株间同源关系比较分散, 整体呈现散发趋势, 仅...     

基于单细胞测序数据的骨肉瘤预后相关细胞亚群特征分析

目的 通过分析不同骨肉瘤患者肿瘤组织的细胞组成,探究与骨肉瘤预后相关的细胞亚群及特征。方法 下载不同患者骨肉瘤单细胞测序数据及bulk测序数据,提取细胞样本信息进行降维、注释、细胞功能分析,明确与骨肉瘤预后相关的细胞种类,鉴定骨肉瘤预后相关细胞特征。分析具有预后意义的巨噬细胞发育轨迹,根据分化空间差异基因构建骨肉瘤预后模型。结果 不同骨肉瘤患者的细胞组成存在异质性。骨肉瘤中浸润的单核巨噬细胞具有显著预后意义(P=0.003)。4类巨噬细胞组成关键预后单核巨噬细胞亚群,其特征性转录调控因子包括RUNX3(+)、ETS1(+)、HOXD11(+)、ZNF281(+)、PRRX1(+)。巨噬细胞亚群的预后能力随骨肉瘤的恶性进展而增强,其中Prog＿Macro2及Prog＿Macro4亚群巨噬细胞位于发育轨迹终端。基于巨噬细胞分化差异基因的预后模型能够有效区分不同风险骨肉瘤患者的生存率(P<0.001)。结论 巨噬细胞亚群与骨肉瘤预后密切相关,可作为骨肉瘤免疫治疗的关键靶细胞。     

肺结核患者血清外泌体中差异表达的微小RNAs及其功能分析

目的:探究肺结核患者血清外泌体中差异表达的微小RNAs(miRNAs)及其功能。方法:分子排阻法和超滤离心法提取纯化实验组及对照组血清外泌体,粒径检测、透射电镜和Western blot进行鉴定,miRNeasy Micro Kit提取外泌体总RNA;Illumina HiSeq2500高通量测序检测miRNAs表达谱;生物信息学分析实验组和对照组差异表达的miRNAs并预测其靶基因及其靶基因潜在功能。结果:分子排阻和超滤离心获得的微囊泡直径为30～100 nm、形态完整、球形、大小较为均一,表达蛋白TSG101、HSP70、CD63、Calnexin无表达。高通量测序分析显示,实验组显著差异表达的miRNAs共63个,其中32个上调表达,31个下调表达。GO富集分析显示差异表达的miRNAs靶基因生物学过程方面主要富集于细胞组织代谢,细胞组分方面主要富集于细胞器和细胞质,分子功能方面主要富集于催化活性、核酸结合转录因子活性。KEGG富集分析显示差异表达的miRNAs可显著富集于肾素-血管紧张素系统(RAS)、转化生长因子(TGF)、环腺苷酸单磷酸-蛋白激酶A(cGMP-PKG)等信号...     

全外显子组测序和目标序列靶向捕获测序在遗传性视网膜变性基因诊断中的差异

目的:对比外显子组测序(whole exome sequencing,WES)和目标序列靶向捕获测序检测中国遗传性视网膜变性(inherited retinal dystrophies,IRDs)患者致病基因变异的差异。方法:收集182例IRDs家系,所有先证者均接受系统的眼科检查和必要的全身检查,采集患者及家属血样并提取基因组DNA。按照就诊的时间顺序将患者平均分为两组,一组91例接受WES,另一组91例应用本课题组设计并定制的“遗传性眼病基因诊断芯片” (hereditary eye disease enrichment panel,HEDEP)进行IRDs致病基因外显子区域靶向捕获测序。对候选致病基因用Sanger测序进行验证,并对家系成员进行共分离分析,使用多重连接依赖的探针扩增技术对拷贝数变异进行验证,针对二代测序捕获效率低的区域如RPGR ORF15区,应用Sanger 测序补充检测。根据美国医学遗传学与基因组学学会和分子病理学协会(American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology,ACMG/AMP)制定的《ACMG/AMP基因变异分类标准与指南》将检测到的所有基因变异进行分类,本文只包含“致病的”、“可能致病的”的基因变异,不包含“意义不明确的”、“可能良性的”和“良性的”基因变异。结果:应用HEDEP确诊的家系共51例,阳性率为56.04%(51/91);应用WES确诊的家系共30例,阳性率为33.00%(30/91);总阳性率44.51%(81/182)。平均测序深度以及测序覆盖度方面,HEDEP优于WES,此外HEDEP具有检测拷贝数变异潜力。本研究共检测到29个IRDs基因的致病突变,最常见的致病基因为USH2A、ABCA4和RPGR,基因突变频率分别为11.54%(21/182)、6.59%(12/182)、3.85%(7/182);共发现43个新的致病突变,并检测到6例家系携带RPGR ORF15区的突变。结论:针对临床确诊的IRDs病例,HEDEP较WES能获得更高的基因诊断阳性率和更精确的诊断结果,可作为IRDs基因诊断的首选方法,WES可作为其他基因诊断方法的补充手段。同时,本研究丰富了IRDs致病基因的突变频谱,为将来IRDs基因诊断、遗传咨询和基因治疗奠定了基础。     

基因DNA双链四色荧光单道测序的实验研究

作者采用四色荧光单道法对ＰＣＲ产物双链直接测序,通过改进操作方法,获得成功。1　材料与方法1.1　材料手术留标本或纤维支气管镜钳取病变或可疑病变组织,用生理盐水于4℃保存,同时送病检对照。310型ＤＮＡ测序仪,2400型ＰＣＲ仪为美国ＰＥ公司产,微量高速离心机为北京六...     

多疣壁虎断尾后脊髓再生过程中mRNA和微小RNA差异表达谱的分析

目的 分析多疣壁虎断尾后脊髓再生过程中相关mRNA和微小RNA(miRNA)的表达变化,探讨差异表达的mRNA和miRNA在脊髓损伤再生过程中的生物学作用。方法 构建多疣壁虎断尾模型,50只多疣壁虎分为正常组、断尾15 d组和断尾25 d组,每组5只实验重复3次,余5只备用。收集各组标本,提取各组RNA并进行高通量测序。生物信息学分析鉴定组间差异表达的mRNA、miRNA,基因本体论(GO)富集分析差异表达的mRNA功能注释,构建脊髓再生相关的miRNA和mRNA基因调控网络。结果 经测序分析多疣壁虎正常和新生脊髓中mRNA、miRNA的差异表达,断尾15 d组和断尾25 d组分别鉴定到538、510个差异mRNA表达和446、127个差异miRNA表达。GO分析发现,差异表达的mRNA聚集于与细胞增殖、神经发育相关的生物学过程。在脊髓再生相关miRNA及其靶基因调控网络中,断尾15 d组有21个mRNA表达下调,被41个上调的miRNA负向调控;12个mRNA表达上调,受到29个下调的miRNA调控。在断尾25 d组中,8个mRNA表达下调,被10个上调的miRNA负向调控;20个m...     

濮阳市首例发热伴血小板减少综合征病例流行病学调查及基因组特征分析

目的报告濮阳市首例发热伴血小板减少综合征病例, 通过流行病学调查和基因测序了解其流行病学特点并分析濮阳市首例新型布尼亚病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus, SFTSV)分离株S、M、L片段分子特征。方法采用流行病学调查方法, 分析流行病学特点, 用Vero细胞分离病毒, 提取SFTSV核酸, 实时荧光定量PCR进行检测;构建多重PCR法对病毒核苷酸序列进行特异性扩增, 利用二代测序仪进行全基因组测序, DNAStar、MEGA11等生物信息软件进行同源性分析, 构建系统进化树。结果流行病学调查结果显示, 患者及其密切接触者14 d内均无旅居史, 有野外作业史, 无蜱虫叮咬史;血液样本检测SFTSV核酸阳性;SFTSV基因型为E型, 其S、M、L片段基因均为E型, 与GenBank中已知的SFTSV核苷酸序列进行比对, 核苷酸序列同源性分别为94.8%～99.9%、94.0%～99.8%、95.7%～99.7%。结论该患者确诊为濮阳市首例SFTSV感染引起的发热伴血小板减少综合征, 与河南近年来分离株基因分型差异较大,...