心脏特异表达肾素(原)受体转基因小鼠的建立

目的 建立心脏特异表达(p)RR的转基因小鼠,研究(p)RR在心肌病发病过程中的调节作用.方法 将(p) RR基因插入到心脏特异表达启动子α-MHC下游,构建转基因表达载体,通过显微注射的方法建立(p)RR转基因小鼠,PCR法鉴定转基因小鼠的基因型:Western blot和免疫组化的方法检测(p)RR在心脏组织中的表达;利用小动物超声仪检测转基因小鼠的心脏结构和功能;双色免疫荧光共聚焦进行(p)RR蛋白在转基因小鼠中的亚细胞定位,Western blot方法检测了钙泵(ATP2A2)、钠-钙交换体1(NCX 1)以及肌钙蛋白T(cTnT)在转基因小鼠心脏组织中表达量的变化情况.结果 建立了心脏高表达(p)RR的转基因小鼠品系;内源性和转基因高表达的(p)RR蛋白均定位在细胞内高尔基体和内质网上;心脏特异高表达(p)RR蛋白使小鼠心脏收缩功能增强,主要表现在与同窝阴性对照小鼠相比,转基因小鼠收缩期左室内径( LVID,systolic)降低9％ (P＜0.05,n=18),收缩期容积( LVESV,systolic)减少了23％ (P ＜0.05,n=18),射血分数EF( ejection fraction)升高14％ (P＜0.01,n=18),短轴缩短率FS( fraction shortening)升高20％ (P ＜0.01,n=18);和心脏收缩功能和钙离子相关的ATP2A2和NCX 1表达均下调,而cTnT表达量上调.结论 在心脏中过表达(p)RR能够引起心脏收缩功能明显增强,同时直接或间接调节ATP2A2、NCX 1和cTnT表达.提示(p)RR可能是调节心脏中的钙离子而参与影响心肌功能.     

造血干细胞全标记红色和绿色荧光转基因小鼠的筛选

目的 对五种荧光转基因小鼠造血干细胞中的荧光标记细胞进行分析,筛选造血干细胞全标记红色和绿色荧光转基因小鼠,为造血干细胞分化机制体内示踪研究提供理想的动物模型.方法 采用活体荧光影像系统对两种红色荧光转基因小鼠品系C57BL/6J-TgN(CAG-DsRed-1和CAG-DsRed-2) ZLFILAS和三种绿色荧光转基因小鼠品系C57BL/6J-TgN(CAG-EGFP-1、CAG-EGFP-2和CAG-EGFP-3)ZLFILAS的荧光标记进行比较;采用流式细胞术检测各转基因小鼠的骨髓lin(-)c-kit(+)Sea-1+(LSK)造血干细胞荧光标记细胞比率,根据标记比率筛选造血干细胞全标记红色和绿色荧光转基因小鼠.结果 活体荧光影像分析表明转基因小鼠均系统性表达红色或绿色荧光.流式细胞术检测表明LSK造血干细胞中高度表达红色和绿色荧光,其中,C57BL/6J-TgN(CAG-DsRed-1)ZLFILAS和C57BL/6J-TgN(CAG-EGFP-1)ZLFILAS的造血干细胞全部为荧光标记细胞.结论 筛选获得在造血干细胞中全标记的红色和绿色荧光转基因小鼠,可为造血干细胞体内研究提供有效示踪工具.     

心脏特异表达人源FAM55A转基因小鼠的建立

目的建立心脏特异表达的人源FAM55A转基因小鼠,为研究该基因在心肌病发病中的作用提供模型。方法 Western blot检测FAM55A在野生型小鼠与cTnTR141W转基因小鼠心脏组织中的表达变化及其在野生小鼠的组织表达谱。克隆人源FAM55A基因入α-MHC启动子下游构建a-MHC-FAM55A表达载体,显微注射法建立FAM55A转基因小鼠。PCR鉴定转基因首建鼠的基因型。Western blot鉴定人源FAM55A在转基因小鼠心脏中的表达,超声检测转基因小鼠心脏的几何构型和功能。HE染色检测转基因小鼠心脏的病理改变。结果 FAM55A在野生型小鼠心脏中有少量表达,在扩张型心肌病小鼠的心脏中表达增加。建立了1个心脏组织特异表达人源FAM55A转基因小鼠品系。与野生型小鼠相比,FAM55A转基因小鼠的心脏收缩期和舒张期左室前壁从1月龄到5月龄持续增厚,3月龄转基因小鼠心脏射血分数和短轴缩短率稍有增强,1月龄和5月龄转基因小鼠心脏功能则与同龄野生型小鼠相比无变化。组织学检测显示,转基因小鼠心脏左室心肌细胞不均匀肥大,但不发生紊乱。结论 FAM55A在扩张型心肌病小鼠的心脏中表达上调,建立了心脏特异表达的人源FAM55A转基因小鼠,为进一步和心肌病小鼠模型杂交,研究该基因在心肌病发病中的作用提供了工具。     

CaMK Ⅱα基因启动子的克隆和神经细胞特异性Cre表达载体的构建

目的克隆和鉴定CaMKⅡα基因启动子序列，构建神经细胞特异性Cre重组酶的真核表达载体。方法采用高保真PCR方法分步扩增CaMKⅡα基因5′端8．1kb的调控区DNA片段，该片段包括了CaMKⅡα基因5′端调控区的所有序列。经克隆和部分序列测定后，依次与pCre—IRES—EGFP质粒框架连接，构建载体。结果克隆的CaMKⅡα基因5′端侧翼区酶切图谱与公布的C57BL/6J小鼠相应序列的酶切位点相一致，其中文献报道的富含顺式调控元件的序列与公布的小鼠序列完全相同。CaMKⅡα基因启动子正确地连接于Cre基因的5′端，构建了目标载体。结论这一载体的构建为建立前脑神经细胞特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠奠定了基础，有助于神经系统相关疾病的研究。     

细胞与分子生物学新技术在我国毒理学研究中的应用

近年来 ,随着一些先进的细胞和分子生物学技术的引进与建立 ,我国毒理学研究整体水平得以大大的提高。现介绍几种我国已开展的细胞和分子生物学新技术的原理及其在毒理学领域中的应用 ,包括 :差异显示技术、单细胞凝胶电泳技术、穿梭质粒 p Z189和 p Sp189转染技术、转基因动物和转基因细胞、荧光原位杂交和流式细胞技术。这些技术具有终点明确 ,敏感性高等特点 ,在检测各种不同类型的 DNA损伤和基因突变 ,以及研究细胞毒性和致癌的分子机理方面具有重要的价值     

涂覆承载质粒DNA水凝胶的覆膜血管内支架置入主动脉局部基因转染的实验研究

目的 用部分覆膜血管内支架涂覆阳离子胶原水凝胶(CGH)承载质粒DNA实现主动脉局部的基因转染,为核酸等大分子治疗物质经血管导入提供理论依据.方法 将CGH涂覆于部分覆膜血管内支架的覆膜织物上,以CGH涂层分别承载2种质粒DNA,即编码β-半乳糖苷酶的pCAGGS-LacZ或编码增强绿色荧光蛋白的pEGFP.8只实验兔为日本白色家兔,在主动脉经球囊拖拉损伤4周后置入2枚血管内覆膜支架,分别承载pCAGGS-LacZ和pEGFP.因2枚支架承载的质粒DNA不同,转染后转录的mRNA和表达的蛋白不同,所以2枚血管内覆膜支架置入部位主动脉互为阴性对照.术后3 d对基因转染和表达进行评估.pCAGGS-LacZ的转染和表达通过特异性x-gal染色和反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测.pEGFP的转染和表达通过免疫荧光显微镜观察.结果 在承载pCAGGS桳acZ的CGH涂层部分覆膜血管内支架置入部位的主动脉,尤其是金属支架支杆对覆膜材料支撑良好处主动脉局部x梘al染色阳性,RT桺CR可检测到编码β-半乳糖苷酶的mRNA;免疫荧光显微镜观察未见绿色荧光,该处主动脉近端及远端x-gal染色及RT-PCR结果均为阴性.其他器官,如脑、心、肝、RT.PCR结果均为阴性.在承载pEGFP的CGH涂层部分覆膜血管内支架置入部位主动脉局部,免疫荧光显微镜可观察到绿色荧光;x梘al染色阴性,RT-PCR未检测到编码β-半乳糖苷酶的mRNA.结论 CGH涂层部分覆膜血管内支架置入兔主动脉内,可实现主动脉局部的瞬时基因转染与表达.     

李斯特菌感染对小鼠APC活性的影响

目的：通过对转基因鼠脾T细胞的分化研究,探讨感染初期APC的活性。方法：细胞因子ELISA测定转基因鼠脾T细胞产生的IFN-γ及IL-4,FACS鉴定T细胞为TCR-TG的T细胞（Vβ8.2品系）。结果：感染鼠的APC诱导TG鼠的T细胞向Th1方向分化,未感染鼠的APC诱导TG鼠的T细胞向Th2方向分化,IL-12和IL-4可影响APC对T细胞分化的诱导。结论：感染和外来细胞因子影响APC的提呈诱导活性。     

HCV 5′NCR调控抑制活性的反义寡核苷酸的筛选

目的寻找高效特异的新型抗HCV药物,探讨针对HCV基因的硫代修饰反义寡核甘酸（S-ASODNs）最佳作用靶序列。方法参考HCV5′NCR计算机预测的二级结构图,设计合成了15条S-ASODN、3条正义寡核苷酸及1条随机序列,采用HCV5′NCR调控荧光素酶基因的瞬时表达系统,将S-ASODN与pHCV-neo4共转染,通过荧光素酶活性表达高低,反映S-ASODN对HCV调控基因的抑制活性。结果5条S-ASODN即HCV65、HCV279、HCV363、HCV349及HCV352在25～100nmol/L浓度范围内,对HCV调控基因具有特异性的剂量依赖性抑制活性。当浓度为100nmol/L时,这些ASODN的抑制率可达80％以上,IC50值提示HCV363的抑制活性最强。通过阴性对照实验包括正义寡核苷酸、随机序列及不含HCV序列的靶载体pGL3提示ASODN仅存在轻度非特异性作用。此外,实验结果还提示不同作用靶位的ASODN之间具有一定的协同作用。结论HCV5′NCR第二茎环结构Ⅱa、第三茎环结构Ⅲd和翻译起始区可能是ASODN作用的重要靶序列。     

Stability and homogeneity of transgene expression in isogenic cells

Genetically engineered cells are an important tool not only for basic research applications, but also for biotechnology and molecular medicine. Among the issues yet to be solved for this technology are the consequences of randomly integrating DNA into a cells genome. The problems encountered range from unpredictable expression levels to safety concerns. Recombinase-mediated chromosome engineering is a popular tool for generating stably transfected isogenic cell lines. Using this approach, single-copy integration of foreign DNA fragments can be achieved at predetermined chromosomal loci in the genome. We used such a technology based on the Flp/Flp recombinase target (FRT) recombination system in human 293 cells for comparative promoter studies. The expected integration patterns were obtained with high frequency. In contrast, the phenotypic characterization of expression of the integrated reporter transgene showed remarkable differences between isogenic cell lines, ranging from homogenous expression to mosaic to even complete expression silencing. As long as cell clones with homogenous expression were kept under selective conditions, their expression characteristics could be maintained over a long period. However, this desirable phenotype was progressively lost upon withdrawal of selective pressure. These results were also reflected by the expression instability of the reporter cassette originally inserted in the recipient cell line. Thus, selection for appropriate integration events that ensure reproducible and long-term gene expression has to go beyond the verification of isogenicity.     

Induction of experimental autoimmune encephalomyelitis in transgenic mice expressing ovalbumin in oligodendrocytes

We have used the 5' flanking sequence of the myelin basic protein gene known to include the core promoter and a strong oligodendrocyte (ODC)-specific enhancer to target expression of the well-studied model antigen ovalbumin (OVA) to ODC in transgenic mice. OVA protein was detected in a tissue- and cell-specific manner in these "ODC-OVA" mice. Without immunization, CD4 T cells and B cells remained ignorant of the neo-self antigen expressed in the central nervous system (CNS), as indicated by unimpaired development and lack of activation of OVA/IA(b)-specific TCR transgenic T cells in these mice, and the ability to mount normal OVA-specific recall and antibody responses. Upon immunization with OVA in complete Freund's adjuvant, about half of the transgenic mice developed neurological symptoms characteristic of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Mononuclear infiltrates in the brain and spinal cord contained both macrophages and T cells, similar to classical models of EAE induced by immunization with CNS antigens in adjuvant. The wealth of immunological reagents available to study and manipulate the OVA-specific response should make this new model useful for the investigation of components and mechanisms involved in CNS-specific autoimmunity.