谷氨酸脱羧酶65片段与IL－10双基因真核表达载体的构建与鉴定

 目的 优化以往构建的以预防 1 型糖尿病为目的的全长谷氨酸脱羧酶（GAD）65 DNA疫苗，尝试构建GAD 65片段与IL-10双基因真核表达载体。方法 从GAD65质粒中扩增出GAD190-315片段和GAD490-570片段的cDNA，以overlap PCR法将之分别与hIL-2信号肽cDNA拼接，得到SGAD190-315、SGAD490-570融合基因。以p43.2-mIL-10质粒为模板，用PCR方法扩增出IL-10基因。将SGAD190-315、SGAD490-570融合基因分别与IL-10基因依次克隆入双启动子真核表达载体pBudCE4.1中，构建出2种双基因重组真核表达载体pBud-SGAD190-315/IL-10和pBud-SGAD490-570/IL-10。2种重组真核表达载体经测序鉴定正确后，用脂质体介导的方法转染COS-7细胞，转染后48和72 h以蛋白质印迹法检测细胞裂解产物及上清液中SGAD190-315和SGAD490-570融合基因的表达，ELISA方法检测细胞上清液中IL-10的表达。结果　核酸序列测定表明克隆的SGAD190-315、SGAD490-570融合基因和IL-10基因序列与报告序列一致。蛋白质印迹法和ELISA方法均检测到SGAD190-315/IL-10和SGAD490-570/IL-10重组真核表达载体在COS-7细胞中的表达。结论　成功构建了2种GAD65片段与IL-10双基因真核表达载体，为1型糖尿病的基因疫苗预防研究提供了实验基础。     

谷氨酸诱导海马神经元凋亡涉及线粒体释放细胞色素C

目的：建立体外谷氨酸诱导神经元兴奋损伤模型，探索其凋亡发生是否通过线粒体信号转导途径介导的细胞色素C（Cyt C）释放而实现，为今后干预性使用神经保护剂提供依据。方法:分离及培养新生Wistar大鼠海马神经元，选用合适谷氨酸浓度建立神经元损伤模型；利用LDH测定及流式细胞仪Annexin V/PI双染色法检测谷氨酸暴露后不同时点神经元凋亡及坏死的动态改变；采用Western blotting法检测caspase-3活性及线粒体内和胞浆内Cyt C水平动态变化。结果:谷氨酸诱导神经元损伤呈明显浓度及时间依赖性，50 μmol/L浓度可使LDH释放量明显增加 (18.4%,P<0.05)，暴露后6 h凋亡率显著增加；凋亡发生前，神经元caspase-3活性已明显增高（3 h），6 h达高峰；线粒体Cyt C释放发生在caspase-3增高前，30 min时胞浆内Cyt C水平即明显增加（P<0.05），3 h胞浆内Cyt C水平超过线粒体内，而线粒体内Cyt C水平进行性减少。结论:50 μmol/L谷氨酸可诱导海马神经元凋亡，凋亡机制可能是通过损伤线粒体膜，使Cyt C易位释放入胞浆激活caspase级联反应而致。     

应用磁共振波谱研究针刺对健康人前额叶神经递质影响的性别差异

目的 采用磁共振波谱MEGA-PRESS序列,观察针刺合谷穴对不同性别健康人前额叶内神经递质谷氨酸(glutamate, Glu)、谷氨酰胺(glutamine, Glx)及r-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)浓度变化的影响。方法 分别采集76例健康受试者刺激前及刺激(手针和纤毛针)合谷穴时磁共振波谱(MRS)数据,采用t检验及Pearson统计,分析刺激前后Glu﹢、Glx﹢和GABA﹢浓度变化的性别差异及相关性。结果 手针刺激前男性Glu﹢浓度明显高于女性(P<0.05),手针刺激时男性Glu﹢和Glx﹢浓度均明显高于女性(P<0.05);纤毛针刺激前男性Glx﹢浓度明显高于女性(P<0.05),纤毛针刺激时男性Glu﹢和Glx﹢浓度均明显高于女性(P<0.05);但手针和纤毛针刺激前和刺激时男性GABA﹢浓度与女性比较,差异无统计学意义(P>0.05)。手针刺激前和刺激时,性别与Glu﹢及Glx﹢浓度均呈正相关(P<0.05);纤毛针刺激前和刺激时,男性与Glu﹢及Glx﹢浓度呈正相关(P<0.05);手针和...     

地黄饮子改善AD小鼠星形胶质细胞损伤调节突触结构功能的作用机制

目的：探讨地黄饮子改善AD小鼠脑中星形胶质细胞损伤及保护突触结构功能的作用机制。方法：40只4月龄雄性APP/PS1转基因小鼠随机分为模型组、模型+地黄饮子(2.5 g·kg^-1)组,每组20只;40只同背景、同月龄C57BL/6J小鼠,随机分为正常组、正常+地黄饮子(2.5 g·kg^-1)组,每组20只。正常+地黄饮子组和模型+地黄饮子组给予地黄饮子灌胃,正常组和模型组均给予等量无菌生理盐水,每天灌胃1次,连续给药150 d。采用小鼠避暗箱实验和Y迷宫自由交替实验测试小鼠学习记忆能力。采用液质联用质谱仪(LC-MS)测定样品中谷氨酸(Glu)和谷氨酰胺(Gln)含量;长时程增强(LTP)实验检测脑组织的突触可塑性;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测小鼠脑组织兴奋性氨基酸转运蛋白2(EAAT2),突触后致密物-95(PSD95)及突触素(SYN)的表达水平;免疫荧光法评估EAAT2的定位及表达;比色法检测小鼠脑组织Na⁺-K⁺ATP酶活性。结果：与正常组比较,模型组小鼠在避暗箱实验中停留...     

酸性神经肽1对小鼠大脑氨基酸类神经递质及cGMP影响的实验研究

目的 :探讨酸性神经肽 (bovineacidicneuropeptide 1BANP 1)对小鼠脑内氨基酸类递质 (谷氨酸和γ 氨基丁酸 )及cGMP的影响。方法 :将小鼠随机分为 6组 (每组 15只 ) ,其中 5组按 15mg/kg腹腔注射BANP 1,将小鼠在注射后 0 5h ,1h ,2h ,3h ,4h处死并取脑匀浆 ,另一组为注射生理盐水对照组 ,在注射盐水后 1h处死并取脑匀浆 ,用 75 %冰乙醇抽提氨基酸类物质及cGMP并沉淀蛋白质。应用滤纸电泳法对小鼠大脑谷氨酸 (glutamicacid ,Glu)和γ 氨基丁酸 (γ aminobutyricacid ,GABA)进行测定 ,应用放射免疫法对小鼠大脑环磷酸鸟苷 (cyclicmonophos phateguanosine ,cGMP)进行测定。结果 :腹腔注射BANP 1后 ,各项指标在不同时间的结果分别与对照组比较 :Glu浓度在 1h、2h时明显高于对照组 (P <0 0 1) ,0 5h、3h、4h时差异无显著性 (P >0 0 5 )。GABA浓度在 2h、3h时显著高于对照组 (P <0 0 1) ,0 5h、1h、4h时差异无显著性 (P >0 0 1)。cGMP浓度有一定升高 ,1h 2h时显著升高 (P <0 0 1) ,其余各时间组差异无显著性 (P >0 0 5 )。结论 :BANP 1急性用药后在一定时间可升高脑内Glu、GABA及cGMP水平     

一氧化氮对谷氨酸单钠脑损害小鼠学习记忆能力的影响

目的　观察谷氨酸单钠 (MSG)对小鼠学习记忆的影响及血浆、脑内NO含量的变化。方法　给断乳分窝小鼠MSG灌胃 ,每天 2次 ,连续 30d ,31d早灌胃后对小鼠进行迷宫行为训练 ,2 4h后对其进行迷宫记忆检测 ,用硝酸还原酶法检测血浆脑内的NO含量。结果　MSG对小鼠学习记忆能力有影响并存在剂量效应关系 ,其血浆、脑中NO含量均升高并有显著差异 (P <0 .0 5 )。结论　NO可加重MSG对小鼠学习与记忆的损害作用。     

谷氨酸脱羧酶抗体在成人隐匿性自身免疫性糖尿病的诊断意义

谷氨酸脱羧酶抗体 (ＧＡＤ65-Ａｂ)是近年来发现一种新的 1型糖尿病患者胰岛 β细胞自身抗体 ,与糖尿病的病理及胰岛 β细胞分泌功能密切相关 ,对早期诊断成人隐匿性自身免疫性糖尿病 (ＬＡＤＡ)有着重要的临床意义。1　对象与方法1 1　对象　糖尿病组 1 2 6例 ,平均年龄 4 8 5± 1 3 6岁。按ＷＨＯ( 1 985年 )糖尿病诊断标准确定为 2型糖尿病 ,发病年龄≥ 2 5岁。正常对照组 1 8例 ,平均年龄4 2 7± 8 5岁 ,为健康体检者。1 2　方法 　所有对象测体重指数 (ＢＭＩ)体重 (ｋｇ) /身高2 (ｍ2 ) ,血清ＧＡＤ65 Ａｂ采用酶免法 ,糖化血红蛋…     

酸性神经肽1对小鼠脑谷氨酸和GABA含量的影响

目的 :探讨酸性神经肽 1(bovineacidicneuropeptide 1,BANP 1)对小鼠脑内谷氨酸 (glutamicacid ,Glu)和GABA含量的影响。方法 :将小鼠随机分为 6组 (每组 15只 ) ,其中 5组按 15mg/kg腹腔注射BANP 1,分别在注射后0 .5h ,1h ,2h ,3h ,4h处死小鼠并取脑匀浆 ;另一组注射生理盐水作对照 ,注射后 1h处死并取脑匀浆 ,用体积分数75 %冰乙醇抽提氨基酸类物质并沉淀蛋白质。应用纸电泳法测定Glu和GABA。结果 :腹腔注射BANP 1后 ,与对照组比较 ,Glu含量在注射后 1h ,2h时明显高于对照组 (P <0 .0 1) ,0 .5h ,3h ,4h时差异无显著性 (P >0 .0 5 ) ;GABA含量在 2h ,3h时显著高于对照组 (P <0 .0 1) ,0 .5h ,1h ,4h时差异无显著性 (P >0 .0 5 )。结论 :BANP 1急性用药后在一定时间内可升高脑内Glu、GABA水平     

Graves＇病患者血清GAD-Ab含量的测定

目的：研究谷氨酸脱羧酶抗体(GAD-Ab)与Graves＇病病程及浸润性突眼的关系。方法：用ELISA法测定51例Graves＇病患者血清中的GAD-Ab。结果：20例阳性,阳性率39.2％,其中病程＜6月组,GAD-Ab阳性率7.7％,明显低于病程＞6月组(P＜0.01),Graves′病并浸润性突眼组,阳性率为57.7％,明显高于非浸润性突眼组(P＜0.01)。结论：GAD-Ab的测定有助于了解Graves＇病病程及监测浸润性突眼。     

c-fos反义寡核苷酸对谷氨酸神经毒性鼠脑损伤的防护

目的　探讨c-fos基因的表达在谷氨酸神经毒性中的作用。方法　在9只SD大鼠侧脑室注射c-fos反义寡核苷酸以阻断脑组织c-fos基因的表达,并用c-fos正义寡核苷酸为对照。观察脑组织中水、电解质含量和突触体内Ca2+浓度的变化,并采用细胞形态计量分析及免疫组织化学方法,观察大脑皮质、海马CA1区神经细胞数目、形态的变化及c-fos基因的表达。结果　c-fos反义寡核苷酸可有效地阻断脑组织c-fos基因的表达,降低脑组织c-fos阳性细胞率（9.4%±2.8%和74%±3%,P＜0.01）,抑制谷氨酸神经毒性所致的脑组织含水量（79.9%±0.4%和82.3%±0.8%,P＜0.01）、钠（5.05mg/g干重±0.39mg/g干重和5.98mg/g干重±0.50mg/g干重,P＜0.01）及细胞内Ca2+（176nmol/L±35nmol/L和344.12±50.13,P＜0.01）含量的增加,抑制谷氨酸所致大脑皮质（157±10和145±7,P＜0.01）及海马CA1区（297.64±18.3和210±19,P＜0.01）神经细胞的丢失,减轻神经细胞的形态学损伤。c-fos正义寡核苷酸无此效应。结论　c-fos基因的表达在谷氨酸神经毒性脑损伤的发生中起有重要作用,阻断c-fos基因的表达可以拮抗谷氨酸神经毒性。