腺苷酸环化酶激活剂调控FMRl基因启动子活性及作用位点CRE的鉴定

目的本研究试图证明，特异性腺苷酸环化酶激活剂forskolin（FSK）可以通过调控FMRl启动子区内的MSE／CRE位点而再激活封闭的FMRl基因。方法拟以FMRl启动子MSE／CRE位点为研究对象，在不改变MSE的整体结构功能的情况下，运用分子生物学方法诱导CRE位点突变，达到其＇~CRE功能目的，从而建立正常MsE以及两种CRE突变启动子M1、M2双荧光素酶报告基因系统，比较CRE在正常或灭活情况下，FSK药物对FMRl诱导效果的影响。结果成功构建FMRl启动子区MSE／CRE位点双荧光素酶报告基因系统，结果显示当CRE位点正常时，FSK对活性低下的FMRl启动子有显著地激活作用，而当CRE位点突变之后，FSK则无此作用，由此证实CRE位点是FSK重启FMRl基因的关键位点。结论提示腺苷酸环化酶激活剂FSK可能主要是通过FMRl启动子区内的MSE／CRE重叠位点，经cAMP通路实现了对FMRl基因的调控。     

性传播疾病

几种性传播疾病病原体检测芯片的制备——石岗等(北京军事医学科学院放射医学研究所100850)；《军事医学科学院院刊》，2004，28(5)：405-409[目的：为了同时多样本检测和鉴别淋病奈瑟球菌、沙眼衣原体和解脲脲支原体3种重要的性传播疾病病原体，制备了寡核苷酸检测芯片。方法：针对3种病原体和荧光素酶基因设计特异的引物和寡核苷酸探针，采用硫代和氨基双功能探针修饰技术制备寡核苷酸芯片，     

阳离子脂质体介导的虫荧光素酶基因表达

目的 研究阳离子脂质体Lipofectin介导虫荧光素酶基因在不同细胞株中的表达。方法 质粒pDR2luc在大肠杆菌DH5a中扩增后用碱裂解法提取,并经Sepharose 2B凝胶过滤柱层析,通过凝胶电泳及紫外分光光度计分析纯度、定量,以Lipofectin分别转染人肝癌细胞株HepG2、SMMC7721、人肾癌细胞株GRC及非洲绿猴肾细胞COS7,然后以液体闪烁计数仪单光子计数法测定荧光素酶活性。结果 荧光素酶活性在4种细胞株中均有表达,且均有显著性差异(均P<0.05)。结论 阳离子脂质体Lipofectin可用于多种真核细胞基因转染。     

CACNB2基因多态性与原发性高血压的关联性研究

目的 探讨钙离子通道β2亚基基因(calcium channel β2 gene,CACNB2)多态性与温州汉族人群原发性高血压的相关性及应用荧光素酶报告基因技术检测rs7069292不同等位基因对基因表达的影响.方法 收集原发性高血压患者637例,以血压正常者600名作对照,采用飞行时间质谱分型技术对CACNB2基因rs2228645、rs2357928、rs7069292、rs7099380、rs10764319和rs11014166共6个SNP位点进行分型.构建CACNB2基因5’上游-2831 bp到-2460 bp的rs7069292的侧翼序列的荧光素酶报告基因载体.结果 高血压组rs7069292 CT基因型频率及C等位基因频率高于正常对照组(5.20％ vs.2.17％,2.59％ vs.1.08％,均P＜0.05),分型未发现rs7069292 CC基因型;含rs7069292 C等位基因的启动子活性与T等位基因相比明显增高,差异有统计学意义(P＜0.05);其余5个SNP位点各基因型频率及等位基因频率与对照组比较差异均无统计学意义(均P＞0.05).结论 CA CNB2基因rs7069292多态性与温州汉族人群原发性高血压病有关联,T＞C变异可能是CACNB2基因功能表达的一个影响因子.     

肝原位移植瘤裸鼠模型的建立及活体荧光成像检测

目的 建立能够通过活体荧光成像系统实时监测肿瘤进展的肝原位移植瘤裸鼠模型.方法 重组质粒pcDNA3.1-Luc转染细胞构建稳定表达荧光素酶的PLC/PRF/5肝癌细胞株,将该细胞注入裸鼠肝脏实质内,应用活体成像技术动态监测肿瘤进展情况,解剖荧光信号阳性裸鼠观察肿瘤组织生长情况.免疫荧光检测肿瘤组织中HBsAg表达.结果 对裸鼠肝原位移植瘤应用活体荧光系统成像,在肿瘤细胞注射部位检测到荧光信号,解剖动物后可在肝脏组织中观察到异质细胞团块.免疫荧光证实移植瘤中有HBsAg表达.结论 肝脏原位移植瘤裸鼠模型建立成功,为抗肝癌药物的研发提供了工具.     

稳定表达hTERT/Luc的小鼠黑色毒瘤肺转移模型的建立

目的 建立稳定共表达荧光素酶基因和人端粒酶逆转录酶(hTERT)的小鼠黑色素瘤B16细胞系,并通过尾静脉注射的方式建立小鼠肿瘤肺转移模型.方法 利用DNA重组技术将hTERT基因和荧光素酶基因Luc定向插入到真核表达载体,构建真核表达质粒pIRES-neo-hTERT和pIRES-hyg3-Luc,利用阳离子脂质体LipofectamineTM 2000共转染小鼠黑色素瘤B16细胞,经G418及潮霉素B加压筛选出稳定转染的细胞株.应用Western blot法及免疫荧光法检测hTERT和Luc基因在B16细胞中的表达;将稳定共表达hTERT和Luc的B16-hTERT/Luc细胞株通过尾静脉注射的方式接种雄性C57BL/6小鼠建立肿瘤肺转移模型,并通过活体成像技术检测小鼠肺部肿瘤的生长.结果 建立了稳定共表达hTERT和Luc的小鼠黑色素瘤B16单克隆细胞株B16-hTERT/Luc,经检测hTERT基因和荧光素酶基因Luc在单克隆细胞株中的表达分别为84％和98％.通过尾静脉注射的方式成功建立了小鼠肿瘤肺转移模型,应用活体成像技术能方便地检测到B16-hTERT/Luc肿瘤在小鼠体内的生长情况.结论 成功建立了可用于活体成像技术检测的稳定表达hTERT的小鼠黑色素瘤肺转移模型.     

带荧光素酶基因的乙型脑炎病毒SA14-14-2感染性克隆的构建及鉴定

目的：构建带有荧光素酶基因的乙型脑炎（简称乙脑）病毒感染性克隆,并通过体外拯救获得恢复病毒,用于乙脑病毒致病机理研究、病毒感染在小鼠体内的动态分布以及乙脑疫苗免疫效果评价的高通量方法建立。方法：应用反向遗传学、融合PCR以及无缝拼接等体外重组技术,将荧光素酶报告基因（F-LUC）插入到乙脑病毒SA14-14-2全长感染性克隆的5''非编码区与C蛋白编码区之间,线性化后体外转录为RNA并转染BHK21细胞,在细胞感染和动物试验分别检测恢复病毒的拯救和F-LUC的表达情况。结果：成功构建了带有F-LUC报告基因的SA14-14-2乙脑病毒全长感染性克隆,并拯救获得了重组病毒。基因序列分析及细胞与动物水平均证明拯救的病毒可较高水平表达荧光素酶基因。结论：本研究构建出带有荧光素酶报告基因F-LUC的SA14-14-2感染性克隆,并拯救获得带有荧光素酶的重组乙脑病毒,为乙脑血清中和抗体的高通量筛选、病毒感染在小鼠体内的动态分布和致病机理研究奠定了基础。     

AP-2α对基质金属蛋白酶-20作用的研究

目的:通过研究AP-2α转录因子对基质金属蛋白酶-20(matrix metalloproteinase-20,MMP-20)基因表达的调控作用,进一步明确AP-2α的功能,为研究AP-2α在釉质形成中的作用奠定基础。方法:利用RT-PCR法、双荧光素酶报告基因检测系统、染色体免疫共沉淀技术等来分析AP-2α与MMP-20启动子区域的转录调控能力。结果:小鼠成釉细胞转染AP-2αsiRNA后,成釉细胞中MMP-20 mRNA的表达水平显著上调。染色体免疫共沉淀结果显示,AP-2α可能通过与MMP-20启动子特征性序列相互作用,从而调控MMP-20的表达。双荧光素酶报告基因检测显示预测结合位点突变后,AP-2α对MMP-20启动子的表达水平无显著影响。结论:AP-2α基因沉默可显著上调MMP-20的mRNA表达水平;而AP-2α过表达可显著抑制MMP-20活性。提示AP-2α转录因子与成釉细胞内MMP-20启动子的特征性序列相互作用,从而调控MMP-20的表达水平。     

变形链球菌荧光报告株的构建和鉴定

目的探讨变形链球菌(S.mutans)荧光素酶(luc)基因报告株构建方法,拟为探讨抗菌剂对多菌种生物膜中S.mutans的作用提供研究基础。方法将S.mutans UA159乳酸脱氢酶(ldh)基因及其上游部分约1100000片段克隆至自杀质粒pFW5-luc的多克隆位点,构建重组质粒,并经酶切和测序证实。采用自然转化的方法,实现重组自杀质粒和S.mutans UA159同源序列的单次交换。结果经过聚合酶链反应(PCR)和测序分析,筛选出具有报告活性的S.mutans ldh-luc基因荧光报告株。结论成功构建了S.mutans ldh-luc基因荧光报告株。