氯胺酮对脂多糖诱导下人脐静脉内皮细胞活化的影响

目的 观察氯胺酮和N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体非竞争性拮抗剂MK-801对脂多糖(LPS)刺激下人脐静脉内皮细胞(HUVECs)胞间粘附分子-1(ICAM-1)表达及核因子-kappa B(NF-kB)易位表达的影响。方法 采用Jaffe方法培养的HUVECs随机分为10组:对照组(C组,RPMI-1640),LPS组(L组,LPS1μg/ml),氯胺酮组(K组,依浓度不同分为KⅠ、KⅡ、KⅢ、KⅣ亚组,即氯胺酮12.5、25.0、100、300μmol/L LPS1μg/ml),MK-801组(M组,依浓度不同分为MⅠ、MⅡ、MⅢ、MⅣ亚组,即MK-801 1.25、2.50、10、30μmol/L LPS1μg/ml)。在37℃、5％CO_2中孵育18h后,用流式细胞仪检测ICAM-1的表达阳性率。NF-kB易位表达的测定分组处理同上,在LPS1μg/ml刺激2h后,用免疫组化(SP)方法测定内皮细胞中NF-kB p65亚基的表达。结果 KⅡ、KⅢ、KⅣ亚组可抑制LPS作用下HUVECs表面ICAM-1的表达和细胞内部NF-kB的易位表达(P<0.05),且两者的变化呈正相关(r=0.985,P<0.01)。M组各亚组对LPS作用后HUVECs表面ICAM-1的表达和NF-kB的易位表达无明显影响(P>0.05)。结论 氯胺酮对炎症反应中内皮细胞的活化具有抑制作用,但并非通过NMDA受体途径。     

Polymyxin B antagonizing biological activity of lipopolysaccharide

Objective ： To investigate the mechanism of polymyxin B （ PMB ） antagonizing the biological activity of Hipopolysaccharide （LPS）. Methods： The affinity of PMB for LPS and lipid A was assayed by biosensor, and the neutralization of PMB for LPS （2 ng/ml ） was detected by kinetic turbidimetric limnins test. The releases of TNF-α and IL-6 in murine peritoneal macrophages （PMφ） after exposure to LPS （ 100 ng/ml） were detected, and the expression levels of TLR4, TNF-α and IL-6 mRNA in PMφ induced by LPS （100 ng/ml） were measured by RT-PCR. Results： PMB had high-affinity to LPS and lipid A with dissociation equilibrium constants of 18.9 nmol/L and 11.1 nmol/L, respectively, and neutralized LPS in a dosedependent manner. Furthermore, PMB could markedly inhibit the expressions of TLR4, TNF-α and IL-6 mRNA and the release of cycokines in LPS-stimniated murine PMφ. Conclusions： PMB neutralizes LPS and inhibites the expression and release of cycokines in macrophages, in which the affinity of PMB for lipid A plays an important role.     

一氧化碳保护大鼠肠道对抗LPS的作用机制

目的： 探讨外源性CO对LPS攻击时大鼠肠道的保护作用及作用机制。 方法： 血气分析监测大鼠呼吸参数，在1、3、6 h的时点上，分别对空白组、脂多糖组（LPS，5 mg/kg）、低浓度CO吸入组（CO 250 mL/M3）、腹腔内CO注射组（CO 2 mL/kg）、脂多糖CO吸入组（LPS 5 mg/kg+CO 250 mL/M3）和脂多糖血症CO腹腔内注射组（LPS 5 mg/kg+CO 2 mL/kg），用硫代巴比妥酸法（TBA）测定肠道丙二醛（MDA）含量，用羟胺法测定超氧化物歧化酶（SOD）活性，并应用RT-PCR检测肠道组织内的血红素氧合酶-1（HO-1）mRNA的变化。 结果: 给予250 mL/M3的CO持续吸入以及2 mL/kg的CO腹腔内注射，在1、3、6 h时点上，大鼠无缺氧情况的出现。两种方法给予外源性的CO，均降低了内毒素血症时大鼠肠道组织中的MDA含量，提高了SOD的活性，同时诱导了肠组织的HO-1 mRNA 的表达。 结论: 低浓度的CO吸入（250 mL/M3）和一次性腹腔内注射CO（2 mL/kg）补充对大鼠是安全的，补充低浓度或小剂量的外源性CO可以对脂多糖血症肠道提供保护作用，并可以刺激HO-1的产生，促进内源性的CO产生发挥抗炎作用。     

HO-1在CCK-8减轻脂多糖所致的急性肺损伤中的作用

目的： 探讨血红素氧合酶（HO）-1在八肽胆囊收缩素（CCK-8）减轻脂多糖（LPS）所致急性肺损伤（ALI）中的作用。方法: 将大鼠随机分为5组：正常对照组、LPS组、CCK-8+LPS组、LPS+Hm（氯血红素，CO供体）组、LPS+ZnPP（锌原卟啉，HO-1特异性阻断剂）组。各组给药后2 h、6 h、12 h行支气管肺泡灌洗、检测支气管肺泡灌洗液（BALF）中中性粒细胞（PMN）数目；进行肺组织的形态学观察；测定肺组织中丙二醛（MDA）含量和HO-1蛋白活性；应用RT-PCR和Western blotting技术检测给药后6h肺组织中HO-1 mRNA和蛋白的表达情况。结果: LPS组肺组织出现损伤性变化，同时BALF中PMN数目、肺组织中MDA含量、HO-1蛋白活性、HO-1 mRNA和蛋白的表达均高于相应对照组（均P<0.05）；CCK-8+LPS和LPS+Hm组肺组织损伤程度、BALF中PMN数目和肺组织中MDA含量低于相应LPS组，而肺组织中HO-1蛋白活性、HO-1 mRNA和蛋白的表达均高于相应LPS组（均P<0.05）；LPS+ZnPP组肺组织损伤程度、BALF中PMN数目和肺组织中MDA含量分别高于相应LPS组，而肺组织中HO-1蛋白活性、HO-1 mRNA和蛋白的表达分别低于相应LPS组（均P<0.05）。结论: CCK-8可部分通过HO-1介导的抗氧化、抑制PMN聚集等效应来发挥减轻LPS所致的肺损伤作用。     

LPS影响p38蛋白在单核细胞内定位

目的： 探讨 LPS作用下p38蛋白激酶激活的动力学特点及其在细胞内超微结构中的定位。方法： 应用激酶活性测定、胶体金标记的免疫电镜技术观察LPS刺激前后p38蛋白激酶的动力学特点及在单核细胞株Raw264.7中的分布特征。结果： 动力学检测结果显示，LPS作用后15 min，p38磷酸化活性明显升高，30 min达到高峰，2 h达基线水平；p38在LPS浓度为100 μg/L时达最大激活效应。超微定位结果显示，未受刺激的及EGF刺激的细胞，p38在胞浆和胞核中金颗粒呈弥散性分布，金颗粒弥散在细胞的各个部分，如细胞质中线粒体、内质网、溶酶体；单核细胞株受到LPS刺激后，细胞核区的金颗粒明显增多，而胞浆区域的金颗粒显著减少。结论： 单核细胞株Raw264.7受LPS刺激后，其p38蛋白激酶由胞浆移位到胞核。     

脂多糖对人脐静脉内皮细胞ET-1、eNOS、iNOS mRNA表达的影响

目的：观察脂多糖（LPS）对人脐静脉内皮细胞ET-1、eNOS、iNOSmRNA表达的影响，在分子水平上进一步探讨LPS影响人脐静脉内皮细胞分泌ET-1、NO的机制。方法：选用体外培养的第3代人脐静脉内皮细胞，以100 μg/L浓度的LPS与之共孵育6 h。提取总RNA，运用半定量RT-RCR的方法，对ET-1、eNOS、iNOS mRNA的表达情况进行分析。结果：ET-1的灰度比值分别为：正常对照组0.82，LPS组1.32；eNOS的灰度比值分别为：正常对照组1.20，LPS组0.65；iNOS组的灰度比值分别为：正常对照组0.20，LPS组0.19。结论：低浓度的LPS对人脐静脉内皮细胞ET-1 mRNA的表达有促进作用，对eNOS mRNA的表达有抑制作用，对iNOS mRNA的表达则无显著作用。     

衰老大鼠急性肺损伤诱导肾功能受损

目的:观察衰老大鼠的急性肺损伤(ALI)是否可进一步诱导肾功能受损。方法:Wistar雄性大鼠40只, 复制成衰老模型, 然后再随机分成对照组(静脉注射生理盐水), ALI组(静脉注射脂多糖, LPS)及LPS组(左心室内注射LPS), 后两组再分2h及6h组。每组8只。注LPS后2h或6h收集血并取肺、肾。制备肺、肾组织匀浆待测。结果:ALI组在注LPS后仅至6h时血中肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)含量才有显著升高(均P＜0.01)。而LPS组Cr、BUN含量均无显著升高。ALI组血中乳酸(LD)、丙二醛(MDA)及一氧化氮(NO)含量在注LPS后2h时均显著升高(P＜0.05, P＜0.01);而肺组织中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-P_X)及Na⁺-K⁺-ATPase活性均显著下降(均P＜0.01);上述变化持续至观察的6h时。ALI组在注LPS后仅至6h时, 肾组织中MDA、NO含量才有显著升高(均P＜0.01)及GSH-P_X、Na⁺-K⁺-ATPase活性显著下降(P＜0.01)。而在LPS组, 除注LPS后2h时的血中和2h、6h的肺组织中NO含量显著升高(均P＜0.05)及2h时的肺组织中Na⁺-K⁺-ATPase活性显著下降(P＜0.05)外, 其它均无显著变化。结论:给衰老大鼠静脉内注射5mg/kg的LPS可致ALI, 并可进一步诱导肾功能受损。     

α-MSH对脂多糖诱导小鼠腹腔巨噬细胞CD14和TLR4 mRNA 表达的影响

目的：观察α-黑色素细胞刺激素(α-MSH)对脂多糖（LPS）诱导小鼠腹腔巨噬细胞CD14和TLR4 mRNA表达的影响，探讨α-MSH拮抗LPS的作用机制。方法：用半定量逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）的方法检测LPS诱导体外培养的小鼠腹腔巨噬细胞CD14和TLR4 mRNA表达水平和给予α-MSH后对CD14和TLR4 mRNA表达的影响。结果：正常静息小鼠腹腔巨噬细胞只表达少量的CD14和TLR4 mRNA,给予LPS刺激后6 h，两者表达明显强于正常对照（P<0.01），并且其表达量随着LPS刺激时间的增加维持在高水平，24 h达到峰值，在48 h CD14 mRNA的表达降到正常水平，而TLR4 mRNA的表达仍然维持在高水平。在LPS刺激的同时给予α-MSH，CD14和TLR4 mRNA的表达则明显低于LPS组（P<0.05），而且α-MSH这种效应与其使用浓度有关，0.1 nmol/L α-MSH不影响LPS诱导的CD14和TLR4 mRNA的表达，而当α-MSH的浓度达到1、10、100 nmol/L则能显著影响CD14和TLR4 mRNA的表达（P<0.05），但各个浓度组之间的作用没有明显差别（P>0.05）。结论：α-MSH抗LPS的效应可能与其下调LPS信号转导通路关键受体CD14和TLR4 mRNA的表达有关，从而干扰LPS跨膜信号转导，阻碍巨噬细胞活化。     

N-乙酰半胱氨酸对脂多糖诱导的小鼠肝MAPK磷酸化的影响

目的： 探讨N-乙酰半胱氨酸（NAC）对脂多糖（LPS）诱导的肝MAPK磷酸化的影响。方法: 雄性昆明种小鼠54只随机分为对照组(n=6)：0.9 % NaCl 0.2 mL ip；LPS组（n=24）：LPS 5 mg ip；NAC+LPS组（n=24）：NAC 150 mg·kg-1·d-1ip，连续3 d；第3 d NAC灌胃后1 h时，LPS 5 mg ip。将小鼠分别在注射LPS或生理盐水后0.5 h、1 h、2 h和6 h时，在戊巴比妥钠麻醉下开腹取肝，测定肝MDA和还原型谷胱甘肽（GSH）含量；Western blotting方法测定肝脏MEK1/2、ERK1/2、p38MAPK磷酸化水平，放免法测定肝TNF-α含量。结果: NAC预处理使肝MDA含量明显下降，使肝GSH含量升高。NAC预处理显著抑制了LPS所致的肝MEK1/2、ERK1/2、p38MAPK磷酸化，同时使肝TNF-α水平显著降低。结论: 在LPS诱导的急性肝损伤过程中，活性氧（ROS）在激活MAPK信号转导中起重要作用。NAC通过其抗氧化作用部分抑制了LPS诱导的MAPK磷酸化，使TNF-α生成减少，从而发挥抗损伤作用。     

高同型半胱氨酸诱导血管内皮功能障碍促进微循环障碍和微血栓形成

目的：采用蛋氨酸灌胃复制高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia,HHcy)致内皮功能障碍,在此基础上，联合脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和角叉菜胶（carrageenan，Ca）造成大鼠体内广泛微血栓形成，观察血管内皮损伤和功能障碍对大鼠体内微血栓形成的促进作用。方法: ①内皮损伤模型的建立。SD大鼠随机分为对照组（control）、内皮功能障碍组（HHcy）。HHcy组采用蛋氨酸灌胃4周复制HHcy致内皮功能障碍模型，对照组以等量纯净水灌胃。4 周后检测血浆同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）水平，并取大鼠胸主动脉段进行血管舒张功能检测，同时检测血浆一氧化氮（NO）和血管性假血友病因子（von Willebrand factor，vWF）水平，以评价血管内皮功能状况。②Ca/LPS诱导微血栓形成。SD大鼠随机分为对照组（control）、微血栓组（Ca/LPS）、内皮功能障碍加微血栓组（HHcy＋Ca/LPS）。Ca/LPS组大鼠腹腔注射Ca，16 h再腹腔注射LPS。注射LPS 20 h后心脏采血检测凝血功能和血小板计数，镜下观测肠系膜微循环，24 h大鼠颈动脉采血结束实验，检测血浆NO和vWF值。对照组腹腔注射等量生理盐水，检测指标同模型组。HHcy＋Ca/LPS组大鼠经蛋氨酸灌胃持续4周后，再按照上述方法注射Ca/LPS，观察内皮功能障碍对大鼠微循环障碍和微血栓形成的影响。结果： ①蛋氨酸灌胃4周导致HHcy,血浆vWF水平显著升高，NO水平降低，内皮依赖性血管舒张功能显著降低，提示血管内皮功能受损，大鼠内皮功能障碍模型复制成功。②Ca/LPS组肠系膜微循环可见广泛微血栓形成，注射LPS后20 h ，通过检测凝血指标可见血液处于高凝状态。而与之比较，HHcy＋Ca/LPS组微循环障碍进一步加强，血小板计数减少，血浆NO值降低，vWF升高；注射LPS 20 h后可见血液处于继高凝状态之后的消耗性低凝状态。结论： 蛋氨酸灌胃4周导致HHcy,诱导血管内皮功能障碍。联合Ca/ LPS 造模可建立微循环障碍和微血栓形成的动物模型，而内皮功能障碍能加速加重微循环障碍和微血栓形成。