去乙酰化酶SIRT1对胰岛B细胞株MIN6分泌功能的影响及其机制研究

目的观察沉默信息调节因子1（SIRT1）对小鼠胰岛B细胞株MIN6胰岛素分泌功能的影响,并初步探讨其机制。方法应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测SIRT1及其下游肝脏X受体（LXRs）的mRNA在MIN6细胞中的表达,应用酶链免疫吸附测定法（ELISA）分别检测SIRT1激动剂白藜芦醇（resveratrol）和SIRT1抑制剂sirtinol对MIN6细胞胰岛素分泌影响的量效与时效关系及SIRT1下游调控基因LXRs抑制剂22（S）-羟化胆固醇（22-S-HC）对MIN6细胞胰岛素分泌功能的影响。结果 SIRT1激动剂resveratrol能够明显的促进MIN6细胞的胰岛素分泌,SIRT1抑制剂sirtinol则对MIN6细胞的胰岛素分泌具有一定的抑制作用,且均呈一定程度的时间-剂量依赖关系。SIRT1的活性变化不会引起LXRs的mRNA表达变化。SIRT1下游调控因子LXRs的抑制剂22-S-HC能够部分拮抗白藜芦醇对MIN6细胞的胰岛素分泌的促进作用。结论 SIRT1的活性对于MIN6细胞的胰岛素分泌具有明显的正相关调节作用,其机制可能与SIRT1下游的核转录因子LXRs的活性有关。     

薯蓣皂苷元衍生物的合成和抗肿瘤活性研究

目的合成薯蓣皂苷元衍生物并研究其体外抗肿瘤活性。方法以薯蓣皂苷元为原料,选择性地合成一系列运用AutoDock4.2对接设计的薯蓣皂苷元衍生物。采用噻唑蓝(MTT)法考察了目标化合物对人恶性黑色素瘤细胞A375、人肺腺癌细胞A549、人肝癌细胞HepG-2以及人慢性髓原白血病细胞K562进行体外抗肿瘤活性试验。结果合成12个新化合物,其结构经1H-NMR和13C-NMR确定,药理实验结果表明,大部分化合物有一定的抗肿瘤活性。结论大部分化合物有良好的抗肿瘤活性而对正常细胞无毒或低毒性。     

瞬时弹性扫描仪在肝纤维化诊断中的应用价值

瞬时弹性扫描仪(Fibroscan,FS)是一种新型的、无创性的通过测定肝脏硬度值来评估慢性肝脏疾病患者肝纤维化程度的仪器.他具有操作简单、快速、重复性好等优点.目前,FS不仅用于慢性丙型肝炎患者肝纤维化的测定,也可用于其他原因引起的肝脏疾病的肝纤维化测定.FS对测定早期肝硬化及合并肝硬化并发症患者的肝脏硬度值有较大的价值.由于FS能被患者普遍接受及可以重复测定,因此可用于监测肝脏纤维化的进展或逆转,指导临床治疗.但FS在临床应用中也存在一些影响因素和一定局限性.本文就FS在肝纤维化诊断方面的应用价值作一综述.     

抗癌药CA4P与不同种属血浆蛋白结合的规律

目的 研究抗癌药Combretastatin A4 phosphate(CA4P)与不同种属血浆蛋白结合的规律.方法 采用平衡透析法分离结合药物和游离药物,采用HPLC法测定Combretastafin A4(CA4)的浓度.结果 经24 h的透析,CA4在3种浓度下与大鼠血浆的蛋白结合率分别是77.86%、74.70%、64.46%;与Beagles犬血浆的蛋白结合率分别是81.70%、81.32%、79.68%;与人血浆的蛋白结合率分别是84.55%、77.04%、71.70%.结论 CA4 0.918～36.720 μg·ml-1,是一种中等程度蛋白结合的药物,虽随CA4浓度的增加结合率略下降,但不同浓度的CA4与大鼠、犬和人血浆蛋白的结合率无统计学差异(P>0.05).     

小鼠MIP-1α-DT390重组免疫毒素原核表达载体的构建及鉴定

目的 构建小鼠MIP-1α基因和白喉杆菌外毒素DT390基因的原核融合表达载体,诱导并鉴定该蛋白的表达.方法 通过RT-PCR获得mMIP-1α基因,通过PCR扩增质粒SPα-DT390获得DT390基因,酶切、连接,构建原核表达载体pET-32a( )-mMIP1-1α-DT390,重组质粒证实构建成功后,转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),通过IPTG诱导融合蛋白表达,并用SDS-PAGE和蛋白免疫印迹法鉴定.结果 成功构建了mMIP-lα与DT390基因的原核融合表达载体pET-32a( )-mMIP-Iα-DT390,重组载体在大肠杆菌中获得了稳定的表达,表达蛋白的相对分子质量与预期值一致,并可被抗mMIP-1α和抗白喉毒素的特异性抗体所识别.结论 获得了mM皿1α与DT390融合基因在原核系统中的稳定表达,为研究其临床应用奠定了基础.     

基因治疗中肝靶向研究的进展

随着DNA重组技术和转基因方法的不断完善,基因治疗研究发展迅猛,并在某些疾病的治疗中取得了令人鼓舞的疗效。肝脏是人体重要的代谢器官,与人类许多遗传性、代谢性、感染性疾病及肿瘤密切相关。肝脏体积大,能分泌大量蛋白入血和完成某些特定基因产物活性所必需的翻译后修饰。因     

和厚朴酚对人宫颈癌细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨和厚朴酚抑制人宫颈癌Hela细胞增殖及诱导其凋亡的作用。方法利用MTT检测和厚朴酚在不同浓度和时间下对Hela细胞增殖的影响;用流式细胞术、Hoechst 33258荧光染色和DNA ladder检测和厚朴酚作用下Hela细胞的凋亡。结果MTT结果显示和厚朴酚可明显抑制Hela细胞的增殖,且抑制率存在剂量和时间依赖性;流式结果表明10μg/mL和20μg/mL和厚朴酚作用细胞24h后,凋亡细胞的比例分别为22.5%和62.2%,而对照组为8.7%;和厚朴酚处理过的Hela细胞,经Hoechst33258染色后细胞、细胞核出现明显的凋亡形态学变化,在DNA琼脂糖凝胶上可见特征性的梯状条带。结论和厚朴酚具有抑制Hela细胞增殖和诱导凋亡的作用。     

hNET基因重组腺病毒载体构建和体外表达

目的以复制缺陷的腺病毒为载体,用细菌内同源重组法构建含有人的去甲肾上腺素转运子(human neurotransmitter transporter,hNET)基因的腺病毒载体。方法利用限制性内切酶KpnⅠ XbaⅠ从pCMV5质粒中切下目的基因hNET,亚克隆至经同样酶切的腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV,形成重组穿梭质粒pAdtrack-CMV-hNET,PmeⅠ酶切线性化后,与pAdeasy-1在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,获得含目的基因的重组体质粒Ad-hNET,PacⅠ酶切后用脂质体Lipofectamine2000转染HEK293细胞,包装成重组体腺病毒。采用PCR技术和Western Blotting对重组体腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒pAdTrack-CMV中带有绿色荧光蛋白报告基因检测表达,经过扩增和纯化,测定病毒滴度。结果测序结果证明hNET序列的正确,PCR、PacⅠ酶切电泳和Western Blotting证实腺病毒重组质粒Ad-hNET构建成功。扩增纯化后测定重组病毒Ad-hNET的滴度为1.2×1010pfu/mL。结论成功构建了能表达hNET基因的重组腺病毒载体,为肿瘤的靶向治疗提供前期的研究工作。     

RNA干扰PLK1基因诱导人前列腺癌细胞PC-3的凋亡研究

目的探讨质粒表达载体介导的RNA干扰抑制PLK1基因表达对人前列腺癌细胞PC-3增殖与凋亡的影响。方法构建靶向人PLK1基因的RNA干扰表达质粒（psh—PLK1）。将该干扰质粒转染到人前列腺癌细胞PC-3中，应用RT—PCR技术分析RNA干扰后各组细胞PLK1基因mRNA表达水平的变化。采用MTT法和细胞形态学分析检测PLK1基因表达受到抑制后PC-3细胞的增殖情况的变化，通过流式细胞分析技术以及PI染色技术进行对各组细胞进行细胞凋亡检测。结果RT—PCR结果显示，转染RNA干扰表达质粒（psh-PLK1）24h和48h后，实验组PC-3细胞较对照组的PLK1基因mRNA表达分别降低了74．6％和91．2％；转染了psh-PLK的PC-3细胞与对照组相比生长受到明显抑制（P〈0．05），而各对照组之间差异无显著性（P〉0．05）；流式细胞仪检测发现转染了psh-PLK1的PC-3细胞较对照组细胞产生了更强的细胞凋亡（39．2％），PI荧光染色可见实验组细胞呈现出典型的细胞凋亡形态学变化。结论RNA干扰PLK1基因能够有效地抑制PC-3细胞中PLK1基因的表达，从而抑制PC-3细胞的生长与增殖，并诱导PC-3细胞产生凋亡。     

乙肝病毒X蛋白增强小鼠体内HBV的转录及复制

目的 观察小鼠体内乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBx)对HBV基因转录和复制水平的影响.方法 应用高压射体内转染法将野生型HBV重组质粒、HBx表达缺失的HBV重组质粒及HBx表达质粒DNA通过尾静脉快速注射入小鼠体内,应用Southern和Northem印迹分别检测小鼠肝组织中HBV DNA复制中间体及HBV mRNA水平.结果 野生型HBx表达缺失的HBV重组质粒注射组小鼠肝组织中均检测到HBV的复制与转录;HBx表达缺失的HBV重组质粒注射组HBV基因转录和复制水平较野生型HBV重组质粒注射组、HBx表达缺失HBV重组质粒与HBx表达质粒共注注射组弱,生理盐水注射组未检测到HBV的转录与复制.结论 HBx的表达缺失可导致体内HBV基因转录和复制水平的下降,而外源HBx的表达可逆转这种因HBx表达缺失引起的HBV复制及转录的减弱,提示HBx增强小鼠体内HBV基因转录和复制.