针刺不敏感大鼠在诺维本损伤后的针效变化

目的观察针刺不敏感大鼠经诺维本损伤后的针刺镇痛效应变化。方法以针剌“后三里”穴的镇痛痛阈为指标，筛选出针刺不敏感大鼠，对针剌不敏感大鼠行诺维本损伤后再针刺“后三里”，测定针刺前后痛阈。结果针剌不敏感大鼠经诺维本损伤处理后针刺痛阀提高非常明显。结论损伤作用可能能激发大鼠的针刺敏感性。     

神经生长液含药血清对神经元生长和雪旺细胞增殖的影响

目的 观察神经生长液含药血清对体外培养的背根神经节神经元生长和雪旺细胞增殖的影响,探讨其促损伤神经修复的机制.方法 制备神经生长含药血清;采用新生大鼠背根神经节及雪旺细胞体外培养,通过形态学分析,观察神经生长液含药血清对背根神经节神经元突起生长的影响;采用MTr、BrdU标记和细胞计数法,观察神经生长液含药血清对雪旺细胞活力及其增殖的影响.结果 高剂量的神经生长液含药血清,可有效地促进大鼠背根神经节神经元生长;高、低剂量的神经生长液含药血清均能显著增加大鼠雪旺细胞的活力,促进雪旺细胞增殖.结论 神经生长液含药血清具有促进神经元生长、增强雪旺细胞活力、促进雪旺细胞增殖作用.     

异硫氰酸荧光素标记动态观察天花粉蛋白对黑色素瘤B16细胞的损伤

目的:应用异硫氰酸荧光素标记天花粉蛋白,在激光共聚焦显微镜下直接观察天花粉蛋白进入黑色素瘤B16细胞的动态过程并分析其对黑色瘤B16细胞的损伤作用。方法:实验于2003-08/2004-08在南通大学神经再生重点实验室完成。将常规传代培养的黑色素瘤B16细胞用胰酶消化,以5×109个/L的浓度种植于24孔培养板。将天花粉蛋白、异硫氰酸荧光素-天花粉蛋白、异硫氰酸荧光素-牛血清白蛋白分别加入培养细胞中,终浓度为50mg/L,同时加入等量生理盐水作为正常对照组,每组再分别设3,6,12h不同孵育时间组。异硫氰酸荧光素标记天花粉蛋白后,利用激光共聚焦显微镜观察异硫氰酸荧光素-天花粉蛋白进入细胞的过程及其荧光强度,CCK-8细胞毒性实验评估各组细胞存活率、并用单细胞凝胶电泳及hoechst33258染核观察天花粉蛋白对黑色素瘤B16细胞致DNA损伤作用。结果:①终浓度50mg/L的异硫氰酸荧光素-天花粉蛋白孵育3h时已经进入黑色素瘤细胞,6h时进入细胞量达到最高,12h时已轻度下降,各时间点比较差异有统计学意义(P<0.01)。异硫氰酸荧光素-天花粉蛋白组与异硫氰酸荧光素-牛血清白蛋白组荧光强度差异有显著性(P<0.01)。②终浓度50mg/L异硫氰酸荧光素-天花粉蛋白、天花粉蛋白孵育黑色素瘤细胞3,6h后利用单细胞电泳和Hoechst33258染色未观察到核形态的变化;但孵育6h后CCK-8细胞毒性实验显示活细胞数量明显下降;孵育12h后出现DNA损伤的特征性彗星尾现象,并观察到明显的核浓缩和边集现象,出现特征性凋亡小体。结论:孵育6h时天花粉蛋白进入细胞量最多,但并没有明显的细胞DNA损伤的作用,而孵育12h时产生明显的细胞毒作用和凋亡的发生。     

Genistein对去卵巢后大鼠基底前脑神经元一氧化氮合酶表达及认知功能的影响

目的:观察去卵巢大鼠植物雌激素替代治疗后基底前脑一氧化氮合酶阳性神经元的表达和其认知功能在去卵巢后的时程变化。方法:实验于2004-07/2005-07在南通大学基础医学院人体解剖学教研室完成。3月龄雌性大鼠48只随机抽签法分为假手术组、去势组、Genistein替代组和雌激素替代组,每组12只。卵巢切除前,各组大鼠行避暗回避实验行为学检测。各组大鼠的处理:①去势组:切除双侧卵巢。②Genistein替代组:切除双侧卵巢后进行Genistein替代,剂量100μg(溶于200μLDMSO)。③雌激素替代组:切除双侧卵巢后进行雌激素替代,皮下注射苯甲酸雌二醇,剂量10μg(溶于100μL无菌芝麻油)。④假手术组:只切开双侧腰肌不触及卵巢,随即缝合伤口,相同条件下存活4周。药物注射隔日1次,时间固定,持续4周,分别于最后1次注射24h后进行灌注固定。各组大鼠在灌注前1周进行避暗回避实验。脑切片用NADPH-d组织化学方法染色,观察基底前脑内侧隔核、斜角带核垂直支脑区一氧化氮合酶阳性神经元的分布,并进行计数和统计分析。结果:实验过程中无动物死亡,全部进入结果分析。①去势前各组大鼠避暗回避实验的探索次数和滞留时间差异无显著性(P均>0.05);去势后行替代治疗1,2周后,各组大鼠避暗回避实验的探索次数和滞留时间差异无显著性(P均>0.05);替代治疗4周后,Genistein替代组和雌激素替代组大鼠的探索次数比去势组明显减少,滞留时间比去势组明显延长(P<0.05)。②大鼠基底前脑一氧化氮合酶阳性神经元染色为深蓝色,胞体边界清晰,突起明显,为双极或多极细胞。内侧隔核的一氧化氮合酶阳性细胞主要分布于中线两侧,呈倒“V”字形排列,体积较小,胞体多呈梭形,各组大鼠的神经元数目在术后各时间点的差异不明显。在斜角带核垂直支则呈“人”字形排列,胞体较内侧隔核大,多呈锥形或椭圆形,多为多极神经元。各组大鼠神经元的数目呈动态变化,Genistein或雌激素替代组一氧化氮合酶阳性神经元数目上升,而去势组减少,替代治疗后1,2周内,Genistein或雌激素替代组与去势组之间差异无显著性(P>0.05);第4周时Genistein或雌激素替代组一氧化氮合酶阳性神经元的数目接近于假手术组水平,与去势组间差异有显著性(P<0.01)。结论:去卵巢后行替代治疗能增加大鼠基底前脑一氧化氮合酶阳性神经元的表达,改善大鼠认知功能,可能对中枢神经系统退行性病变起保护作用。     

MPTP诱导的小鼠帕金森病模型中相关脑区iNOS时程表达变化

目的:观察1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)诱导的小鼠急性损伤PD模型中纹状体(CPu)、黑质致密部(SNpc)、额叶皮层联合区(FrA)和腹侧被盖区(VTA)中iNOS基因和蛋白的时程表达变化。方法:用RT-PCR和Western blot方法对MPTP诱导的小鼠PD模型中相关脑区iNOS基因和蛋白的表达量进行检测。结果:MPTP诱导的小鼠PD模型中SNpc和CPu脑区iNOS基因和蛋白在给药后多个时间点均有显著性表达,其中1d是表达高峰;VTA和FrA脑区iNOS基因和蛋白的表达没有SNpc和CPu脑区表达显著。结论:表达增高的iNOS可能对SNpc和VTA脑区DA能神经元及CPu和FrA脑区的DA能神经元末梢起了损伤作用,从而导致了DA能神经元的减少及其末梢退变的发生。     

β1,4-GalT I在大鼠坐骨神经损伤后脊髓和背根神经节中的表达

目的:观察β1,4-GalTImRNA在坐骨神经损伤后相应节段脊髓和背根神经节中的表达变化。方法:采用real-timePCR方法,分析β1,4-GalTImRNA在大鼠坐骨神经损伤后相应脊髓和背根神经节中的表达变化。运用原位杂交检测β1,4-GalTI在脊髓和背根神经节中的定位情况。结果:Real-timePCR显示,与正常脊髓和背根神经节相比,β1,4-GalTI在坐骨神经损伤后发生表达变化。原位杂交结果显示β1,4-GalTI在正常脊髓中的表达较弱,主要表达于脊髓灰质中,而损伤后在灰质和白质中均可见有大量的阳性信号。β1,4-GalTI在背根神经节中则主要定位于神经元。结论:本实验发现β1,4-GalTI在正常脊髓和背根神经节中有表达,并在坐骨神经损伤后发生表达变化。提示β1,4-GalTI在周围神经损伤后再生和退变过程中可能发挥一定的作用。     

Src抑制的蛋白激酶C底物在细胞因子诱导的C6胶质瘤细胞中表达的改变

目的研究肿瘤坏死因子（TNF-α）对培养的C6胶质瘤细胞中Src抑制的蛋白激酶C底物（Src-suppressed C Kinase Substrate,SSeCKS）表达的影响。方法根据TNF-α刺激时间与浓度的差异,将培养的C6胶质瘤细胞随机分为TNF-α时间刺激组与浓度刺激组,运用实时荧光定量PCR（Realtime PCR）、免疫印迹和免疫细胞化学法分析SSeCKS的表达变化和亚细胞定位。结果细胞因子TNF-α可引起C6胶质瘤细胞中蛋白激酶C（Protein kinase C,PKC）底物的广泛磷酸化,并以时间及浓度依赖的方式上调PKC底物SSeCKS的表达。免疫细胞化学分析显示,正常情况下,SSeCKS散在分布于细胞质,浓集于细胞伸长的足突中。TNF-α刺激后,SSeCKS向核周迁移。这些改变可被PKC的抑制剂Ro-31-8220部分抑制。结论TNF-α可诱导C6胶质瘤细胞中PKC的活性,上调SSeCKS表达,这些改变与PKC的活性相关,提示SSeCKS可能参与胶质细胞中炎症信号的转导。     

磷酸化细胞外信号调节激酶在海马提取液诱导神经干细胞向神经元分化过程中的表达

目的 探讨细胞外信号调节激酶(ERK)信号转导通路在海马提取液诱导神经干细胞向神经元分化过程中作用。 方法 切割12只SD大鼠右侧穹隆海马伞,14d后分别取切割侧和正常侧海马制成匀浆,离心收集上清液,蛋白定量后备用。将获取的鼠胚海马源性神经干细胞培养在24孔板中,分成3组,每组8孔,于无血清条件下,切割组加切割侧海马提取液;正常组加正常侧海马提取液;对照组不加上述海马提取液。培养14d后进行微管相关蛋白2(MAP-2)与p-ERK的免疫荧光双标检测。 结果 MAP-2阳性神经元数量、胞体面积和细胞周长在切割组、正常组和对照组中依次减少,3组之间均有显著性差异。MAP-2、p-ERK免疫荧光双标细胞数量在切割组、正常组、对照组中也依次下降,但双标记细胞数占MAP-2阳性神经元数的百分比却反而依次增加,两者3组之间均有显著性差异,双标细胞大多为欠成熟细胞。 结论 切割穹隆海马伞侧海马提取液较正常海马提取液有明显促使神经干细胞向成熟神经元分化的作用;形态学初步证实ERK信号转导通路可能与神经干细胞向神经元分化有关。     

人类神经干细胞/祖细胞和神经球的超微结构特点

BACKGROUND： Biological and morphological characteristics of neural stem/progenitor cells （NSPCs） have been widely investigated. OBJECTIVE： To explore the ultrastructure of human embryo-derived NSPCs and neurospheres cultivated in vitro using electron microscopy. DESIGN, TIME AND SETTING： A cell biology experiment was performed at the Brain Tumor Laboratory of Soochow University, and Jiangsu Province Key Laboratory of Neuroregeneration, Nantong University between August 2007 and April 2008. MATERIALS： Human fetal brain tissue was obtained from an 8-week-old aborted fetus; serum-free Dulbecco＇s modified Eagle＇s medium/F12 culture medium was provided by Gibco, USA; scanning electron microscope was provided by Hitachi Instruments, Japan; transmission electron microscope was provided by JEOL, Japan. METHODS： NSPCs were isolated from human fetal brain tissue and cultivated in serum-free Dulbecco＇s modified Eagle＇s medium/F12 culture medium. Cells were passaged every 5-7 days. After three passages, NSPCs were harvested and used for ultrastructural examination. MAIN OUTCOME MEASURES： Ultrastructural examination of human NSPCs and adjacent cells in neurospheres. RESULTS： Individual NSPCs were visible as spherical morphologies with rough surfaces under scanning electron microscope. Generally, they had large nuclei and little cytoplasm. Nuclei were frequently globular with large amounts of euchromatin and a small quantity of heterochromatin, and most NSPCs had only one nucleolus. The Golgi apparatus and endoplasmic reticulum were underdeveloped; however, autophagosomes were clearly visible. The neurospheres were made up of NSPCs and non-fixiform material inside. Between adjacent cells and at the cytoplasmic surface of apposed plasma membranes, there were vesicle-like structures. Some membrane boundaries with high permeabilities were observed between some contiguous NSPCs in neurospheres, possibly attributable to plasmalemmal fusion between adjacent cells. CONCLUSION： A large number of autophagosomes were observed in NSPCs and gap junctions were visible between adjacent NSPCs.     

坐骨神经横断伤后远侧段组织的形态学及相关因子表达变化

目的:通过制备GFP小鼠和B6小鼠坐骨神经横断伤模型,应用免疫组化技术以及RealTime-PCR技术观察和分析周围神经损伤后远侧段组织的形态学及相关因子表达变化。方法:制备GFP小鼠坐骨神经横断伤模型,应用免疫组化技术分别染色S100蛋白以显示施万细胞,染色NF蛋白以显示轴突;结合GFP小鼠的自发荧光以及Hoechst核染观察横断伤后不同时间点远侧段组织的形态学变化。制备B6小鼠坐骨神经横断伤模型,应用RealTime-PCR技术检测横断伤后远侧段组织中相关营养因子BDNF、NGF、CNTF及抗凋亡因子Bcl-2 mRNA的表达变化。结果:坐骨神经横断伤后,远侧段施万细胞S100蛋白的表达第7天时达到高峰,第14天时下降,形成狭长细胞索带;第21～28天时仅少数细胞S100蛋白阳性。远侧段NF免疫组化产物于横断伤后第7天时断裂呈碎片状,第28天时碎片亦基本消失不见。远侧段非特异核染数目随损伤时间延长而增加。同时,在远侧段整个溃变过程中,神经基膜管结构仍然可见。坐骨神经横断伤后,BDNF mRNA表达第1～3周内逐渐上调,其中第3周时达到高峰(P<0.01),第4周时下降到与正常值相比无统计学意义的水平。NGF mRNA表达第1周时达到高峰(P<0.01),第2周时比第1周有小幅下降,但仍然具有统计学意义(P<0.01),第二周以后下降到与正常值相似的水平。CNTF mRNA表达则在损伤后第1周时下降了35%,第2周时继续下降到正常水平的42.7%,其下降均具有统计学意义(P<0.01),第3周时有所回升,第4周时下降到低点。Bcl-2 mRNA表达在损伤后第1周时下降,第2、3周时上升,第3周时达到高峰,并且上升具有统计学意义(P<0.01)。结论:坐骨神经横断伤后4周,远侧段神经组织中神经基膜管结构仍然存在。神经营养因子BDNF、NGF、CNTF mRNA的表达时相不同,提示其表达调控机制不同。Bcl-2 mRNA表达变化与施万细胞凋亡相关。