S100A4表达与胃癌生物学行为及预后的相关性研究

目的研究胃癌及对应正常胃黏膜组织中S100A4基因的表达,分析其与胃癌临床病理及预后的相关性。方法QRT-PCR检测20例胃癌及对应正常胃黏膜组织中S100A4 mRNA的转录。构建胃癌组织芯片,免疫组织化学方法检测S100A4蛋白在208例胃癌组织及其配对正常胃黏膜和转移淋巴结组织中的表达。结果20例胃癌中,55%(11/20)S100A4转录水平升高,平均升高倍数为2.31倍,S100A4表达升高者多为有淋巴结转移的进展期胃癌患者。208例胃癌患者中,S100A4在正常胃黏膜、癌灶、淋巴结转移灶的表达阳性率依次为9.4%、28.1%、32.2%,差异具有显著性(P<0.05);癌灶中S100A4表达与肿瘤浸润深度相关,浸润至肌层以下者表达阳性率高于浸润至黏膜和黏膜下层者(P<0.05);进展期胃癌中S100A4表达升高比例(29.3%)高于早期胃癌(9.4%,P<0.05);癌灶以及转移淋巴结组织中S100A4高表达者比低表达者预后差(P<0.05)。多因素分析显示,S100A4在转移淋巴结中的表达水平是胃癌的独立预后影响因子。结论在胃癌的进展过程中存在S100A4的异常表达,该现象是一个散发的晚期事件;对转移淋巴结中S100A4蛋白表达的分析有助于胃癌的预后判断。     

损伤胰腺提取液对骨髓间充质干细胞分化为胰岛样细胞的作用

背景：损伤胰腺提取液含有胰腺再生过程的特异性生长因子，能够促进β细胞系增殖和胰岛素分泌，可能有助于胰岛再生和细胞分化。 目的：观察损伤胰腺提取液对骨髓间充质干细胞分化为胰岛样细胞的影响。 设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2005-06/2007-03在解放军军事医学科学院生物工程研究所完成。 材料：清洁级雄性Sprague-Dawley大鼠6只，由解放军军事医学科学院实验动物中心提供。活化素A、视黄酸、胰蛋白酶抑制剂为Sigma公司产品，链脲菌素为Sigma公司产品。 方法：大鼠腹腔注射链脲菌素，2 d后血糖浓度超过10 mmol/L时取其胰腺组织，在含有胰蛋白抑制剂的磷酸盐缓冲液中制备匀浆，2次离心后取上清，即为损伤胰腺提取液。采用密度梯度离心法分离大鼠骨髓间充质干细胞，当传代细胞生长至70%~80%融合时，随机分为4组：对照组以体积分数为0.02的胎牛血清的低糖DMEM培养11 d；活化素A+视黄酸组以活化素A、视黄酸各自诱导24 h，再以碱性成纤维生长因子、尼克酰胺、尼克酰胺+exendin 4各自诱导3 d；活化素A+视黄酸+损伤胰腺提取液组在前组基础上添加损伤胰腺提取液；损伤胰腺提取液组单纯以损伤胰腺提取液诱导11 d。 主要观察指标：应用免疫细胞化学和反转录聚合酶链反应等方法对分化细胞表型进行检测，ELISA法检测细胞胰岛素的分泌水平。 结果：活化素A+视黄酸组、活化素A+视黄酸+损伤胰腺提取液组有较多的胰岛素阳性反应细胞出现，且后者形成的胰岛样结构较前者大而多；损伤胰腺提取液组可见较少的胰岛素阳性反应细胞及胰岛样结构。各诱导组均检测到胰岛素1 mRNA的表达，培养上清中均可检测到胰岛素的分泌，且活化素A+视黄酸+损伤胰腺提取液组胰岛素分泌水平>活化素A+视黄酸组>损伤胰腺提取液组（P < 0.05）。对照组各项指标均呈阴性表达。 结论：基于前期活化素A、视黄酸及其他成熟因子的诱导方案基础上，损伤胰腺提取液对骨髓间充质干细胞分化为胰岛样细胞具有促进作用，能够提高诱导分化效率。     

河南新乡2008年手足口病病原分离鉴定及病毒基因组特征

目的:对2008年分离自河南新乡手足口病患者粪便标本的病原进行分离鉴定及全基因组序列测定,并同相关毒株序列进行同源性比对和进化分析,以了解新分离病毒基因组序列特征及可能的传播来源.方法:将手足口病患者粪便标本接种敏感细胞进行分离传代培养,制备抗原片进行间接免疫荧光检测,采用特异性引物进行PCR鉴定,将病毒基因组分为8个片段进行RT-PCR扩增,扩增产物纯化后进行PCR测序.通过末端重叠序列拼接成全长病毒基因组序列,利用生物信息学软件对序列进行比对分析,绘制进化树.结果:测序获得的3株EV71病毒基因组全长均为7 405 nt,VPI氨基酸序列同源性达100%.Blast分析表明F3(F8)-Henan-08毒株均与安徽阜阳2008年分离的EV71毒株同源性最高,而F4-Henan-08毒株与我国台湾省2004年分离的EV71毒株同源性最高.序列进化分析表明,新分离毒株属于C4基因亚型.结论:新分离的河南EV71毒株与安徽阜阳分离的毒株可能具有相同来源.     

人ERβ AF1融合蛋白的表达及其多克隆抗体制备

目的: 制备雌激素受体β多克隆抗体.方法: 从人乳腺cDNA文库中PCR扩增ERβ AF1结构域(1～144位氨基酸), DNA 重组插入原核表达质粒pGEX-KG, 转化大肠杆菌DH5α, 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达GST-ERβ AF1融合蛋白.纯化后免疫BALB/c小鼠, 制备鼠多抗血清.通过Western blot和免疫组织化学实验鉴定血清特异性和效价.结果: 成功构建了pGEX-KG/ERβ AF1原核表达载体, 转化DH5α后可高效表达融合蛋白GST-ERβ AF1, 免疫产生的ERβ多抗可特异检测ERβ真核表达载体转染人293T细胞及乳腺癌细胞中ERβ的表达.结论: 制备的ER 抗体对ERβ有反应原性, 效价高, 特异性好, 为进一步研究ERβ的生物学功能奠定基础.     

人尿激酶原全长cDNA基因的克隆

人尿激酶原(pro-UK,又称单链尿激酶)由于具有较好的选择性溶血栓作用而又不引起全身系统性出血,近年来受到国内外学者重视。但自尿中提取含量极少,较有希望的途径是通过基因工程手段来制备,pro-UK含411个氨基酸加上20个氨基酸的信号肽,全长基因编码序列为1293bp。要获得这样较大的cDNA基因有一定难度。国外虽已有几家公司报道他们克隆了pro-UK cDNA基因,但国内尚无报道。1988年我     

表达SARS冠状病毒受体人ACE2转基因小鼠的建立

目的:建立表达SARS冠状病毒的功能性受体人ACE2的转基因小鼠.方法:克隆人2型血管紧张素转换酶(hACE2)的cDNA,连入PCAGGS构建转基因表达载体,以显微注射的方法将5.6 kb的转基因片段引入小鼠的受精卵.采用PCR、Southern印迹、RT-PCR、Western印迹、免疫荧光染色的方法对转基因小鼠进行鉴定.结果与结论:获得了在小鼠肺组织中表达有SARS病毒功能性受体hACE2的两个转基因小鼠系,证明了SARS病毒的S蛋白能很好地和转基因小鼠肺组织中表达的hACE2受体结合,这将为SARS的研究提供一种良好的感染动物模型.     

包装菌株XL-pⅢ的构建及缺陷型辅助噬菌体的制备

目的构建能用来制备基因Ⅲ缺失的辅助噬菌体的包装菌株。方法采用重叠延伸PCR方法将完整的噬菌体基因Ⅲ和氯霉素抗性基因体外拼接起来,利用λRed重组系统将其整合到E.coliXL1-Blue染色体上的组氨酸操纵元位点构建包装菌株,用氯霉素抗性进行筛选,并用PCR及组氨酸表型鉴定;用PCR法构建功能基因Ⅲ缺失的噬菌体基因组,将其转化到包装菌株中培养制备辅助噬菌体,以集落形成来测定滴度。结果重组菌株能在氯霉素抗性平板上生长,PCR扩增可得到目的片段,组氨酸表型缺失,说明靶基因定向重组到了细菌染色体的靶位点,将重组包装菌株命名为XL-pⅢ,以其制备的缺陷噬菌体滴度可达到3.7×108,只具备一次感染力。结论成功构建包装菌株,并能制备辅助噬菌体,有望用于选择感染性噬菌体(SIP)体系。     

非综合征显性遗传性耳聋家系致病基因排除性定位研究

耳聋是人类最常见的遗传病之一。20世纪80年代以来，对遗传性聋的基因定位和基因克隆的研究发展飞速。目前国际上已定位了143个非综合征型遗传性聋的基因座，并成功克隆了24个显性遗传性耳聋相关基因。在已登录的常染色体显性遗传聋57个基因座（DFNA1～DFNA57）中，有29个位点（DFNA1～DFNA18，DFNA20，DFNA25～DFNA28,DFNA30，DFNA32，DFNA34，DFNA36～DFNA38）被定位于染色体的狭窄区段，提供用于筛查的微卫星标记物。     

新型低基础表达Tet-on基因表达系统的构建与鉴定

目的:构建一种新型的具有更低基础表达的Tet-on调控系统,以用于毒性蛋白及 RNA病毒的真核细胞调控合成.方法:对目前常用的Tet-on系统中的四环素调控蛋白(rtTA、tTS)的表达途径进行改进,使得在非诱导条件下调控蛋白的基础诱导活性进一步降低.结果:相比原有的Tet-on系统,新构建的Tet-on系统非诱导状态下的基础表达值下降了一半以上.结论:成功构建基础表达值更低的Tet-on调控系统,为真核调控表达毒性蛋白或合成 RNA病毒打下了基础.     

tPA突变体乳腺表达载体的构建及其在乳腺中的瞬？…

目的：探讨建立乳腺时性表达系统，用于快速检测所构建的乳腺表达载体的有效性。为进行转基因动物实验奠定基础。方法：ＤＮＡ常规操作；孕小鼠乳腺注射；纤维蛋白琼脂糖平板法检测Ｍｕｔ－ＰＡ。结果构建了含有Ｍｕｔ－ＰＡ基因的乳腺表达载体ｐＢ３ｍｔ－ＰＡ，将此载体直接注射到孕小鼠乳腺中进行暂时性表达，产仔后第４天采乳汁，用纤维蛋白琼脂糖平板法检测ｔ－ＰＡ的活性，表达活性可达２０－４０Ｕ／ｍｌ，其活性能被天然的ｔ