登革1型病毒NS1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的重组表达登革1型病毒NS1蛋白并制备多克隆抗体。方法通过RT-PCR扩增编码登革1型病毒NS1蛋白的基因序列,将其克隆到原核表达载体pET-32a(+)后经酶切测序鉴定,获得重组质粒pET-NS1。进一步使用IPTG诱导表达,经免疫印迹鉴定后,采用蛋白浸提方法从SDS-PAGE胶中纯化回收融合蛋白,并通过透析对目的蛋白进行复性;纯化复性后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,通过间接免疫荧光法测定抗体效价。结果成功构建了高效表达登革1型病毒NS1蛋白的原核表达载体,表达的重组NS1蛋白占菌体蛋白总量的50%以上,以包涵体形式存在;免疫印迹表明表达的重组NS1蛋白能够为登革病毒兔抗血清识别,纯化后纯度可达95%以上;免疫小鼠后获得了效价1∶1000的抗登革病毒NS1蛋白的鼠多克隆抗体。结论原核表达的重组NS1蛋白具有良好的免疫原性,诱导产生的多克隆抗体能够有效识别天然NS1蛋白,为进一步研究登革病毒NS1蛋白及其抗体的生物学功能奠定了基础。     

经阴道手术应用于剖宫产后切口妊娠患者的效果与安全性研究

目的:探讨经阴道手术治疗对剖宫产后切口妊娠患者的应用效果和手术安全性。方法:选取2014年3月至2016年10月在重庆市妇幼保健院检查确诊的68例剖宫产后切口妊娠患者为研究对象,按照随机数表法,将其分为经阴道手术组和腹腔镜手术组,每组34例患者。比较两组患者一般资料、手术效果和身体恢复速度(住院时间、住院费用、血β-HCG恢复正常时间、月经复潮时间)、手术安全性评价(手术并发症发生情况、实施手术情况)。结果:经阴道手术组患者的住院时间、血β-HCG恢复正常时间和月经复潮时间明显短于腹腔镜手术组患者,两者差异具有统计学意义(P 0. 05)。经阴道手术组患者的住院费用远低于腹腔镜手术组患者,两者差异具有统计学意义(P 0. 05)。经阴道手术组患者手术并发症总发生率(17. 65%)明显低于腹腔镜手术组(55. 88%),两者差异具有统计学意义(P 0. 05)。经阴道手术组患者手术成功率(97. 06%)明显高于腹腔镜手术组(82. 35%),两者差异具有统计学意义(P 0. 05)。结论:经阴道手术在剖宫产后切口妊娠患者治疗上效果显著、安全可靠,能够有效加快患者术后恢复速度和降低患者经济负担,值得在剖宫产后切口妊娠患者手术治疗中推广。     

两种甲病毒基因组序列的一步RT-PCR检测

目的　通过对不同扩增条件的优化 ,建立两种马脑炎病毒的快速RT -PCR检测方法。方法　根据东部马脑炎病毒和西部马脑炎病毒基因组相应序列设计引物 ,然后采用两步法及两种一步法分别对其基因组序列进行RT -PCR扩增 ,并用琼脂糖凝胶电泳进行观察。结果与结论　三种方法均可从两种马脑炎病毒感染的乳鼠脑和细胞上清中扩增出单一的DNA片段 ,其大小与预期的相一致。与其他两种方法相比 ,本研究所建立的一步法更为简便快速、价格低廉 ,为进一步组装这些病毒的检测试剂盒奠定了基础。     

维甲酸诱导基因Ⅰ信号通路在西尼罗病毒感染中的作用研究

目的 探讨维甲酸诱导基因Ⅰ(RIG-Ⅰ)信号通路在西尼罗病毒感染过程中的作用.方法 用西尼罗病毒Chin-01株感染A549细胞,分别通过RT-PCR和Western blotting检测病毒感染对RIG-Ⅰ及干扰素β(IFN-β)启动子刺激因子-1(IPS-1)表达的影响,通过含CAT报告基因的重组质粒观察病毒感染对干扰素调控因子-3(IRF-3)和IFN-β启动子活性的影响,并用ELISA法检测IFN-β的表达水平,明确西尼罗病毒感染对RIG-Ⅰ信号通路下游信号分子的激活作用.通过瞬时转染法在A549细胞中过表达RIG-Ⅰ,观察其对西尼罗病毒感染的影响.结果 西尼罗病毒感染能够上调RIG-Ⅰ的表达,激活IPS-1、IRF-3等下游信号分子,诱导Ⅰ型IFN的产生.同时,RIG-Ⅰ的过表达能够抑制西尼罗病毒的增殖.结论 RIG-Ⅰ信号通路介导的固有免疫反应可能在西尼罗病毒感染过程中发挥重要作用.     

狂犬病毒载体的构建与鉴定

目的构建狂犬病毒载体,为新型疫苗研究提供依据。方法将狂犬病毒减毒株SAE基因组分段扩增,然后经逐步拼接得到全基因组克隆,并在其中引入转录终止-起始元件和多克隆位点获得重组质粒pSAETOPO。将绿色荧光蛋白(EGFP)基因和西尼罗病毒prME基因分别克隆至pSAETOPO,然后将带有这两个基因的狂犬病毒全长cDNA切下并克隆至pcDNA3.1(+)载体。将获得的重组质粒pcSAE-GFP和pcSAE-ME转染细胞,分别观察辅助病毒对外源基因表达的影响。结果获得狂犬病毒载体质粒pcSAE-GFP和pcSAE-ME,经酶切分析和序列测定表明所构建克隆是正确的。pcSAE-GFP及pcSAE-ME转染细胞后,在辅助病毒存在下可表达相应外源基因。结论构建的狂犬病毒载体质粒可表达外源基因,为进一步获得表达外源基因的重组狂犬病毒奠定了基础。     

登革1型病毒广州06株基因组全长感染性克隆的构建与鉴定

目的:构建本室新分离的登革1型病毒广州06株基因组全长感染性cDNA克隆,为深入研究登革病毒致病机制奠定基础.方法:根据登革1型病毒广州06株基因组全序列中单一酶切位点设计特异引物,分别扩增并克隆5个病毒亚基因组cDNA片段,将其逐一拼接连入pWSK 29低拷贝质粒载体,获得病毒全长cDNA克隆,并将其体外转录为RNA,再转染细胞获得恢复病毒.进一步通过RT-PCR扩增病毒5′和3′非编码区序列和特异性间接免疫荧光对其恢复病毒进行鉴定.结果和结论:构建获得登革1型病毒广州06株基因组全长感染性cDNA克隆,其恢复病毒与野生型病毒具有相似的生物学特性.     

河南新乡2008年手足口病病原分离鉴定及病毒基因组特征

目的:对2008年分离自河南新乡手足口病患者粪便标本的病原进行分离鉴定及全基因组序列测定,并同相关毒株序列进行同源性比对和进化分析,以了解新分离病毒基因组序列特征及可能的传播来源.方法:将手足口病患者粪便标本接种敏感细胞进行分离传代培养,制备抗原片进行间接免疫荧光检测,采用特异性引物进行PCR鉴定,将病毒基因组分为8个片段进行RT-PCR扩增,扩增产物纯化后进行PCR测序.通过末端重叠序列拼接成全长病毒基因组序列,利用生物信息学软件对序列进行比对分析,绘制进化树.结果:测序获得的3株EV71病毒基因组全长均为7 405 nt,VPI氨基酸序列同源性达100%.Blast分析表明F3(F8)-Henan-08毒株均与安徽阜阳2008年分离的EV71毒株同源性最高,而F4-Henan-08毒株与我国台湾省2004年分离的EV71毒株同源性最高.序列进化分析表明,新分离毒株属于C4基因亚型.结论:新分离的河南EV71毒株与安徽阜阳分离的毒株可能具有相同来源.     

三种代血浆分子量的分析超离心鉴定

运用分析超速离心方法分别测定每个代血浆样品的沉降系数(S值)和扩散系数(D值),用最小二乘法对数据处理后,代入Svedberg方程,求出它们的重均分子量。罗氏海星明胶分子量为8,000,木瓜胶分子量12,000,驴皮胶分子量44,600。     

采用银染技术检测聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质

在聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)中常用的染色方法是考马斯亮蓝R-250或G-250(Coomassie brilliant blue)染色法。此法虽然应用方便,但不够敏感。近年来Switzer等人(1979)报道了一种操作简便,比考马斯亮蓝染色效果敏感100倍的银染技术。其最低检出浓度为0.0001μg/mm~2,即达到毫微克的水平,与放射性同位素检出的水平相近,故对一些浓度较低的标本不需浓缩便可直接做分析,如临床上用于血清、蛋白尿、脑脊髓液等蛋白成分的检出,此外也可用于蛋白质多肽肽图及核酸(DNA,RNA)等的分析。     

登革1型病毒广州2006年分离株的基因组特征与进化分析

目的 对2006年分离自广州登革热患者血清的4株登革1型病毒(GZ57/06、GZ63/06、GZ69/06和GZ128/06)进行全基因组序列测定,并同其他毒株序列进行比对分析,以了解其基因组序列特征及可能的传播来源.方法 将登革1型病毒分离株基因组分为9个片段进行RT-PCR扩增,5'与3'末端序列采用RACE法扩增,扩增产物纯化后进行PCR测序.通过末端重叠序列拼接成全长病毒基因组序列,利用生物信息学软件对序列进行比对分析.结果 测序获得的4株广州登革1型病毒基因组全长均为10 735核苷酸(m),编码3 393个氨基酸.5'和3'端各有一段非编码区,长度分别为94nt和462nt.4株病毒的编码区与非编码区核苷酸及氨基酸序列存在一些差异,其中GZ57/06、GZ63/06和GZ69/06毒株的基因组核苷酸和氨基酸序列同源性均在99%以上,而GZ128/06株变异较其他3株大,编码区差异尤其明显.序列比对分析表明,GZ57/06、GZ63/06和GZ69/06毒株均与泰国2001年分离毒株ThD1/0049/01和ThD1/0102/01同源性最高,而GZ128/06毒株与缅甸1998年分离毒株D1.Myanrmr.31987/98同源性最高.这些新分离毒株与东南亚毒株属于同一基因型.结论 新分离毒株可能来自泰国等东南亚国家和地区,不同毒株表型差异可能与其基因组特征具有密切关系.