A scintillation proximity assay for dengue virus NS5 2′-O-methyltransferase—kinetic and inhibition analyses

Dengue virus (DENV) NS5 possesses methyltransferase (MTase) activity at its N-terminal amino acid sequence and is responsible for formation of a type 1 cap structure, m⁷GpppAm^2′-O in the viral genomic RNA. Optimal in vitro conditions for DENV2 2′-O-MTase activity were characterized using purified recombinant protein and a short biotinylated GTP-capped RNA template. Steady-state kinetics parameters derived from initial velocities were used to establish a robust scintillation proximity assay for compound testing. Pre-incubation studies showed that MTase–AdoMet and MTase–RNA complexes were equally catalytically competent and the enzyme supports a random bi bi kinetic mechanism. The assay was validated with competitive inhibitory agents, S-adenosyl-homocysteine and two homologues, sinefungin and dehydrosinefungin. A GTP-binding pocket present at the N-terminal of DENV2 MTase was previously postulated to be the cap-binding site. Interestingly, inhibition of the enzyme by GTP was two-fold lower than with RNA cap analogues, G[5′]ppp[5′]A and m⁷G[5′]ppp[5′]A and about three-fold poorer than a two-way methylated analogue, m⁷G[5′]ppp[5′]m⁷G. This assay allows rapid and highly sensitive detection of 2′-O-MTase activity and can be readily adapted for high-throughput screening for inhibitory compounds. It is suitable for determination of enzymatic activities of a wide variety of RNA capping MTases.     

国产长春瑞宾联合顺铂治疗老年晚期非小细胞肺癌临床观察

目的观察长春瑞宾(NVB)联合顺铂(DDP)治疗老年人ⅢB～Ⅳ期非小细胞肺癌(NSCLC)的临床疗效和毒性反应。方法将51例经病理检查确诊的非小细胞肺癌患者按年龄分为3组:A组,年龄>70岁;B组,60～70岁;C组,年龄<60岁。均采用NP方案治疗,NVB25mg/m2,d1、d8;DDP25mg/m2,d1～d3。每21～28天为1个周期。结果3组的有效率、1年生存率、临床获益率和肿瘤进展时间分别为31%、32%、65%和4.9个月;33%、33%、75%和5.1个月;34%、34%、78%和5.3个月,3组比较无显著性差异。3组患者不良反应均无显著性差异。结论NP方案治疗老年晚期NSCLC有一定疗效,不良反应患者能耐受。     

RP-HPLC法测定复合洗脱支架中西罗莫司和普罗布考的含量

目的:建立以反相高效液相色谱法测定复合洗脱支架中西罗莫司和普罗布考含量的方法。方法:色谱柱为Kromasil C18,流动相为乙腈-水(梯度洗脱),流速为1.0mL·min-1,检测波长为277nm,柱温为55℃,进样量为20μL。结果:西罗莫司和普罗布考检测浓度的线性范围均为1.0~20.0μg.mL-1(r=0.9999);平均加样回收率分别为99.47%、98.35%,日内、日间RSD均小于5%。结论:本方法简便、准确,可用于西罗莫司-普罗布考复合洗脱支架的含量测定。     

《临床检验基础》CAI教学课件的制作与应用

结合普通高等教育“十一五”国家级规划教材《临床检验基础》内容，应用Authorware，Flash，Premiere等软件进行了《临床检验基础》CAI教学课件的制作，并广泛应用于教学实践。《临床检验基础》CAI教学课件符合教学规律，内容新颖、操作方便、人机对话良好，能提高学生学习的积极性和教师教学的积极性，并具有较高的实用性。     

黄芪对糖尿病大鼠肾组织血管生成素受体Tie-2表达的作用

目的:探讨血管生成素受体Tie-2在糖尿病大鼠肾组织中的表达以及黄芪对其影响。方法:SD大鼠随机分为正常对照组、糖尿病组和黄芪治疗组。8周后处死大鼠,采用实时定量聚合酶链反应和免疫组化法分别检测3组大鼠肾组织中Tie-2基因和蛋白表达水平。结果:与正常对照组相比,糖尿病组大鼠肾组织Tie-2蛋白表达显著升高(P<0.01);黄芪治疗组大鼠肾组织Tie-2蛋白表达较糖尿病组显著下调(P<0.01)。结论:黄芪通过下调糖尿病大鼠肾组织Tie-2的表达而发挥肾保护作用是其治疗糖尿病肾病的作用机制之一。     

过氧化氢对大鼠离体肺组织精细切片活性的影响

目的研究过氧化氢(H2O2)对离体肺组织精细切片活性的影响,建立肺组织氧化损伤的简易模型。方法制备离体肺组织精细切片,以0.5mLKrebsHenseleit缓冲液作为孵育液,在37℃培养箱内进行孵育。在孵育液中加入H2O2,使其浓度为2mmol/L,分别孵育0(对照组)、5、10、15和20min;然后在不含H2O2的孵育液中进行恢复孵育1h。测定肺片的四甲基偶氮唑盐(MTT)染色、孵育液中乳酸脱氢酶(LDH)和肺片组织ATP含量。结果随H2O2损伤时间延长,MTT染色变浅,其吸光度逐渐减小,损伤时间大于10min组与对照组比较有显著差异(P<0.01)。H2O2损伤10min组肺片的LDH释放多于对照组(P<0.05),损伤时间更长者增加更明显(P<0.01)。H2O2损伤5min组的肺片组织中ATP含量明显低于对照组(P<0.05),损伤时间更长者下降更明显(P<0.01)。经偏相关分析发现,肺片MTT染色与LDH释放呈负相关(r=-0.866,P<0.01),与ATP含量呈正相关(r=0.869,P<0.01)。结论离体肺组织切片在含H2O2的孵育液中进行孵育时,随孵育时间延长其活性降低。此模型简单可靠,可用于肺组织氧化损伤的研究。