微透析－UPLC—MS联用技术在方剂代谢组学研究中的应用

在微透析－MS联用以及UPLC—MS联用技术的基础上，本文介绍了一种新的取样及分析联用技术－微透析－UPLC—MS联用技术，并对其在方剂代谢组学研究中的应用进行了展望。这些联用技术将开拓方剂药代动力学及代谢组学研究的又一个新技术应用时代的开始。     

采用代谢组学策略研究佛手散对急性血瘀大鼠的活血化瘀作用机制

采用冰水浴游泳和皮下注射盐酸肾上腺素法复制急性血瘀大鼠模型。采用UPLC-Q-TOF/MS方法分析正常大鼠、急性血瘀大鼠和给药佛手散干预急性血瘀大鼠尿液之间的内源性代谢物差异,并通过变量重要性投影选取潜在的生物标志物,结合质谱信息和数据库检索对潜在的生物标志物进行鉴定,将鉴定到的生物标志物输入MetPA数据库中构建代谢通路。研究急性血瘀大鼠给药佛手散后大鼠尿液内源性代谢物变化,寻找可能的生物标志物,探讨佛手散的活血化瘀作用机制。结果在急性血瘀大鼠尿液中发现并鉴定了11个潜在的生物标志物,这些标志物主要和苯丙氨酸代谢、色氨酸代谢和鞘脂类代谢3条代谢通路相关。而佛手散可调节急性血瘀模型大鼠体内紊乱的代谢通路并使其向正常状态转归。该研究结果表明代谢组学在中药整体性药效评价、作用机制的阐明等方面具有很好的应用前景。     

乳香-没药配伍前后化学成分溶出变化及其对LPS-诱导的巨噬细胞产生NO的影响

目的:分析乳香-没药配伍前后化学成分的变化,评价差异性化合物对LPS-诱导的小鼠腹腔巨噬细胞产生NO的影响,以期从化学成分变化角度探讨乳香-没药配伍协同增效的物质基础.方法:采用UPLC-Q-TOF-MS/MS联用技术对乳香-没药配伍前后化学成分进行分析,并结合MarkerLynx4.1统计软件分析2味药配伍后的差异性化合物.结果:经PCA分析乳香-没药合提液与合并液色谱图存在明显差异,提示2味药配伍前后化学成分存在显著差异.经OPLS-DA分析及化学成分鉴定,2味药配伍后五环三萜类化合物(α-乳香酸、β-乳香酸等),四环三萜类化合物(榄香酮酸、3-乙酰氧基-16-羟基-24-甲基达玛烷、3-羟基甘遂烷-7,24-二烯-21-酸/3-羟基甘遂烷-8,24-二烯-21-酸等)溶出量显著增加,而环倍半萜类,大环二萜类化合物溶出量均有下降趋势.体外活性评价表明:化合物2-甲氧基-8,12-环氧-吉玛-1(10),7,11-三烯-6-酮,2-甲氧基-5-乙酰氧基-呋喃-吉玛-1(10)-烯-6-酮,3-羰基甘遂-8,24-二烯-21-羧酸显著抑制LPS-诱导的小鼠腹腔巨噬细胞产生NO水平.结论:该研究结果为揭示乳香-没药配伍增强抗炎效应的物质基础提供了一定科学依据与参考.     

基于药物相互作用对当归－川芎配伍养血补血效应研究

目的 采用响应曲面分析法研究当归－川芎配伍养血补血效应相互作用。方法 采用乙酰苯肼和环磷酰胺复合法复制小鼠血虚模型,给予不同配比（0∶1、1∶5、2∶5、2∶3、1∶1、3∶2、5∶2、5∶1、1∶0）不同浓度归芎药对后,观察其对外周血常规、脏器指数的影响,采用多指标综合指数法对各指标进行整合,然后运用响应曲面分析法对整合结果进行分析,应用非线性回归的方法确定量效曲线的各个参数,建立三维响应曲面模型,应用Matlab软件构建响应曲面的三维图形。结果 在整个三维响应曲面中,表现出协同作用的区域明显较大,其次是相加作用,未见明显的拮抗作用区域。当归与川芎的比例从4∶1到2∶1之间,从小剂量到大剂量,均表现为相加作用。而其他比例,则表现出小剂量为相加,大剂量表现为协同作用。结论 本研究结果为中医临床合理地应用当归与川芎提供了科学依据;所采用的方法为定量研究中药配伍相互作用提供了参考。     

基于均匀设计法评价藜芦对人参扶正功效的影响

目的: 考察不同配比及剂量条件下藜芦对人参扶正功效的影响。 方法: ICR小鼠按体重随机分为正常组、模型组及人参不同剂量给药组。小鼠ip环磷酰胺45 mg·kg^-1,隔天1次,共3次制备免疫低下小鼠模型,动物自造模第1天起给药,1次/d,共7 d,以筛选人参有效剂量范围。再采用均匀设计法,按2因素11水平分组给药,观察不同配比及剂量的人参与藜芦合煎液对模型小鼠的免疫器官（脾脏和胸腺）指数、碳廓清能力和血常规的影响。 结果: 模型组较正常小鼠体质量、脏器指数、吞噬功能、血常规均显著下降;单用人参（0.5~8.0 g·kg^-1）使脾脏指数、校正吞噬指数、WBC、RBC、Hb明显升高。均匀设计法评价藜芦对人参功效的影响。 结果: ①合煎液（人参+藜芦0.53~8.05 g·kg^-1）对免疫低下小鼠的免疫器官指数未产生明显影响;②人参∶藜芦<100∶1时,藜芦（0.031~0.13 g·kg^-1）可降低人参增强吞噬细胞功能的作用且强度与藜芦的剂量成正比,当合煎剂总剂量为3.08 g·kg^-1（人参∶藜芦 9∶1）时藜芦的拮抗作用最强;③人参∶藜芦<100∶1时,藜芦（0.034~0.13 g·kg^-1）可抵消人参增高WBC,RBC的作用但不影响其量效曲线,当合煎剂总剂量分别为4.58,3.48 g·kg^-1（人参∶藜芦 9∶1）时藜芦的拮抗作用最强,藜芦也可抵消人参增高Hb的作用使人参的量效曲线降低。 结论: 在药典剂量范围内,藜芦可降低或抵消人参的扶正功效,其作用强度随配比和剂量的不同而改变。     

UPLC-QTOF/MS分析芫花诱导人肝细胞L02损伤的毒性物质基础

目的: 研究芫花提取物诱导人肝细胞L02损伤的毒性物质基础。 方法: 选取人肝细胞L02作为体外实验模型,运用MTT法测定芫花提取物对细胞增殖的影响,并且采用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱(UPLC-QTOF/MS)对芫花提取物及与L02细胞亲和后胞内化学成分进行定性分析。 结果: 芫花提取物对L02细胞的生长抑制呈明显的剂量依赖关系,48 h的IC₅₀为(48.34±4.66)mg·L^-1。通过UPLC-QTOF/MS鉴定的黄酮类成分主要有:芹菜素、3'-羟基芫花素、芫花素、5,4'-二羟基-7,3'-二甲氧基黄酮;二萜原酸酯类成分主要有:芫花酯戊、genkwanine L、芫花酯丙、芫花烯、芫花酯丁、芫花酯庚、芫花酯乙、芫花酯己、芫花酯甲。在芫花提取物亲和的L02细胞中鉴定出3'-羟基芫花素、芫花素、5,4'-二羟基-7,3'-二甲氧基黄酮、芫花酯戊、芫花烯、芫花酯丁、芫花酯乙、芫花酯甲。其中二萜原酸酯类成分芫花酯甲作用L02细胞48 h的IC₅₀为(29.57±2.01) mg·L^-1,黄酮类成分芫花素(0.1～100 mg·L^-1)未发现对L02有显著的细胞毒作用。 结论: 芫花提取物对人肝细胞L02具有细胞毒作用,其中二萜原酸酯类成分与细胞有明显的亲和作用,并具显著的细胞毒作用,是芫花提取物中主要的活性物质。     

基于化学成分相互作用探讨芫花与甘草配伍禁忌的机制

通过研究芫花与甘草合煎液中化学成分相互作用及其变化特点,揭示其"反"的可能特征与机制。以中药"十八反"中芫花/醋芫花-甘草多个不同配比组合为研究对象,采用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF/MS)及超高效液相色谱串联三重四级杆质谱(UPLC-TQ/MS)联用集成技术,分析其化学成分相互作用及其变化特点。结果表明,芫花/醋芫花-甘草不同配比合煎对其中化学物质的溶出具有一定的规律性,芫花不论醋炙与否,与甘草合煎时,随甘草比例升高,芫花中二萜类等毒性成分溶出明显提高,尤其对芫花酯甲、芫花酯乙及芫花酯已的溶出影响最为显著。从反药合煎过程化学物质相互作用促使毒性成分的溶出释放增加导致配伍禁忌的角度,揭示了甘草所含化学成分促使芫花中二萜类等毒性物质的溶出释放增加是芫花与甘草配伍禁忌的物质基础和可能机制之一。     

麻杏石甘汤及拆方对RSV加重型哮喘气道炎症的保护作用及调控TRPV1的机制研究北大核心CSCD

探讨麻杏石甘汤及拆方干预呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)加重型哮喘气道炎症的效应及对瞬时受体电位香草酸亚型1(transient receptor potential vanilloid-1, TRPV1)的调控作用。采用卵清蛋白复合RSV复制加重型哮喘小鼠模型(雌性C57BL/6小鼠),麻杏石甘汤及拆方进行干预。观察各组外周血嗜酸性粒细胞(eosinophil, EOS)和支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)中炎细胞水平、呼吸间歇(Penh)值变化、肺病理损伤,酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)法测定BALF中白细胞介素(interleukin, IL)-4、IL-13、P物质(substance P,SP)、前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)等水平变化,定量实时聚合酶连锁反应(quantitative real time polymerase chain reaction, qPCR)、蛋白免疫印迹法(Western blot)检测小鼠肺组织中TRPV1 mRNA和蛋白表达。体外以IL-4联合RSV刺激16HBE细胞,观察麻杏石甘汤及拆方含药血清干预后TRPV1表达及经TRPV1激动剂刺激后的胞内Ca2+水平变化。结果显示,与空白组相比,模型组小鼠出现明显的哮喘表型,外周血和BALF中各类炎细胞水平、Penh值显著升高(P<0.05,P<0.01),肺组织损伤严重。与模型组相比,全方组、石膏组及麻杏草组外周血和BALF中EOS水平显著下降(P<0.01,P<0.05);全方组和石膏组可显著降低BALF中白细胞、中性粒细胞水平(P<0.01),麻杏草组可下降中性粒细胞水平(P<0.05);全方对外周血和BALF中炎细胞水平的改善作用优于拆方组(P<0.05,P<0.01);50 mg·mL-1氯化乙酰胆碱激发后,全方组和麻杏草组Penh值显著降低(P<0.01),石膏组Penh值下降(P<0.05);麻杏石甘汤及拆方可不同程度减轻肺组织病理损伤;全方组可显著降低BLAF中IL-4、IL-13、PGE2、SP水平(P<0.05,P<0.01),石膏组可下降BLAF中IL-13、PGE2、SP水平(P<0.05,P<0.01),麻杏草组可下降BALF中IL-13、PGE2水平(P<0.05,P<0.01);全方可下调肺组织中TRPV1的蛋白和mRNA表达(P<0.05,P<0.01)。麻杏石甘汤及拆方含药血清干预可下调经IL-4联合RSV刺激的16HBE细胞中TRPV1表达,抑制TRPV1激动剂引起的Ca2+内流,全方组显著优于拆方组(P<0.05)。体内、外实验结果表明,麻杏石甘汤及拆方对RSV加重型哮喘气道炎症具有保护作用,全方药物协同增效,干预作用优于拆方部分,不同组方部分在改善气道高反应性、抗过敏、抗炎方面各有贡献,其机制与调控TRPV1通道和相关炎症介质水平有关。     

基于层次聚类分析与数据图形化技术探讨少腹逐瘀汤与温经汤的组方配伍特点

目的:研究少腹逐瘀汤与温经汤的配伍特点,为治疗妇科瘀血腹痛提供治疗思路及理论依据。方法:对少腹逐瘀汤与温经汤组方药物的药性信息进行量化处理,采用层次聚类分析法、数据图形化技术分别对两方组方特点进行分析。结果:聚类分析结果表明:少腹逐瘀汤10味药物根据其性、味、归经属性聚类为当归、肉桂、小茴香与干姜;没药与延胡索;蒲黄与五灵脂;赤芍与川芎4组。温经汤12味药物聚类为生姜、半夏、吴茱萸与当归;人参、麦冬与甘草;芍药;阿胶、牡丹皮、桂枝与川芎4组。图形化分析结果显示:在归经上,少腹逐瘀汤主要分布在脾(胃)、肝(胆)、心(小肠)经,而温经汤主要分布在脾(胃)、肺(大肠)、肝(胆)、肾(膀胱)经,脾(胃)、肝(胆)两组经络均为两方的重要分布区域;在味的分布上,辛、甘、苦3味是两方共同的重点分布区。体现了少腹逐瘀汤以温经散寒止痛配伍活血祛瘀药,针对少腹瘀血腹痛的病机,而温经汤则寒温消补并施,升降相调,更注重从整体角度调制的用药特点。结论:多种数据挖掘分析方法联用能够更加客观的分析评价中医方剂配伍关系及其用药特点,为妇科瘀血腹痛病症的治疗及方剂现代研究提供参考。     

古今肺痿方的配伍规律研究

目的运用数据挖掘方法,分析肺痿方单味药、药对之间的关联关系,探讨肺痿方的配伍规律。方法收集肺痿方261首,针对古今肺痿方药物配伍和药对特征,对单味药、药对之间的关联关系,分别采用频繁模式、hpriori算法进行分析。结果古今医家治疗肺痿时常选用的药物多具有化痰止咳平喘、补气养阴生津的功效,如桔梗、杏仁、五味子、人参、麦冬等;现代医家对于药物的选择比古代医家更为集中,同时常使用古代医家很少用到的药物,如丹参、当归、川芎等。结论在肺痿方剂的运用中,古今医家在高频药物的使用方面具有明显的差异性。