5株不同群型霍乱弧菌黏粒文库构建及JS9803株文库应用

目的研究5株不同群型霍乱弧菌（VC）黏粒文库的构建。方法染色体DNA提取、酶切,质粒DNA提取、酶切及去磷酸化,连接、包装、转染、铺板,克隆子鉴定和保存、菌落原位杂交,PCR和测序。结果成功构建吴江-2株（EVC流行株产毒株）、86015株（EVC流行株非产毒株）、JS32株（EVC非流行株非产毒株）、JS9803株（0139群VC产毒株）和GD98200株（0139群VC非产毒株）等5株霍乱弧菌的染色体基因组黏粒文库,文库克隆子中插入35～45kb的染色体DNA片段,库容量分别为3000～5000克隆子。从JS9803株文库中筛选出分别携带CTXφ或net—CTXφ基因组的克隆子,后一克隆子携带的rstR—ig2基因为新类型。结论成功构建5株不同群型霍乱弧茵染色体基因组黏粒文库,并对JS9803株文库进行应用。     

霍乱弧菌中存在不含霍乱毒素基因的噬菌体CTXΦ基因组

目的近年研究发现产毒霍乱弧菌的毒素基因ｃｔｘＡＢ由其溶原性噬菌体ＣＴＸΦ编码,这种丝状噬菌体可携带ｃｔｘＡＢ传递给无毒素基因的霍乱菌株。研究认为ｃｔｘＡＢ基因与ＣＴＸΦ基因组中的其它基因是严格共存的。然而在本实验室研究中,于不含ｃｔｘＡＢ基因的ＥｌＴｏｒ型霍乱弧菌（ＥＶＣ）中发现部分菌株含有ＲＳ基因同源序列,为此对这些菌株作ＣＴＸΦ基因组的进一步研究。方法以ＣＴＸΦ基因组中的ｃｔｘＡ、ｃｔｘＢ、ｚｏｔ、ａｃｅ、ｃｅｐ和ＲＳ１结构基因制备探针,对ｃｔｘＡＢ－菌株染色体作Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ检测,并用ＰＣＲ方法检测ＣＴＸΦ的感染受体毒素共调菌毛（Ｔｃｐ）的ｔｃｐＡ基因。结果发现有４株分离自河水的霍乱毒素基因阴性ＥＶＣ菌株仍含有溶原噬菌体ＣＴＸΦ的基因组,为ｃｔｘＡ－ｃｔｘＢ－ｚｏｔ＋ａｃｅ＋ｃｅｐ＋ＲＳ＋菌株,另有一株分离自病人的ＥＶＣ菌株仅表现为ＲＳ＋。这些菌株均含ｔｃｐＡ基因。结论ｃｔｘＡＢ基因并不一定与ＣＴＸΦ其它基因共存于一个菌株中,发现了在霍乱弧菌中溶原噬菌体ＣＴＸΦ基因组内可以不携带毒素基因ｃｔｘＡＢ的存在形式     

基于基因组序列的副溶血弧菌两种分型方法比较研究

  目的  比较基于全基因组测序（WGS）SNP的分型方案和多位点串联重复序列分析（MLVA）分型方案用于我国副溶血弧菌分子分型的能力,并分析两种方法的优缺点及适用情况。  方法  选取我国分离的56株副溶血弧菌,使用6个数目可变串联重复序列（VNTR）位点的MLVA方案和基于全基因组序列SNP的方案对这些菌株进行分子分型分析,通过量化指标评价这两种方法对我国分离的副溶血弧菌的分型能力。  结果  56株副溶血弧菌经MLVA分型,获得31种MLVA型,D值为0.949。 对56株副溶血弧菌进行全基因组测序,获得33个差异明显的基因型,D值为0.967。 两种分型方法对菌株的分辨能力十分接近,分型结果高度一致。  结论  6位点的MLVA分型方案与基于全基因组测序SNP的分型方案具有相似的分型能力,其分型能力稍弱。     

河弧菌AL536_RS29525基因功能研究

  目的  探讨河弧菌基因组中VflT6SS2核心基因簇上游paar基因簇中AL536_RS29525的序列特征、对VflT6SS2分泌功能和杀菌活性的影响以及可能的调控机制。  方法  利用Muscle、GeneDoc软件进行AL536_RS29525基因编码产物的序列特征分析;同源重组技术构建AL536_RS29525的缺失株,PCR扩增AL536_RS29525编码序列克隆于pSRKTc获得回补质粒pSR-29525,继而导入?AL536_RS29525得到回补株;Western Blot （WB）检测相应菌株中VflT6SS2 Hcp蛋白的表达和分泌,以大肠埃希菌为prey的细菌竞争/杀菌实验检测VflT6SS2介导的菌株杀菌能力;基于Lux报告基因的启动子融合系统冷光检测确定AL536_RS29525缺失对VflT6SS2核心基因簇启动子和hcp启动子活性的影响;荧光定量反转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测hcp （tssD2）和vipA （tssB2） mRNA的相对表达水平。  结果  AL536_RS29525同源基因编码蛋白的结构和功能较为保守;缺失AL536_RS29525负性影响VflT6SS2 Hcp蛋白的表达及分泌,降低VflT6SS2介导的菌株杀菌能力,回补AL536_RS29525可恢复缺失株 Hcp 的表达、分泌和杀菌能力;缺失株?AL536_RS29525中hcp （tssD2）和vipA （tssB2）的mRNA表达量均低于野生株;而VflT6SS2的核心基因簇启动子和hcp启动子活性在?AL536_RS29525缺失株和野生株之间无显著差异。  结论  河弧菌AL536_RS29525基因较为保守,与霍乱弧菌以及弗尼斯弧菌的同源基因均具有较高的同源性。 AL536_RS29525基因是河弧菌VflT6SS2的重要组成部分,为其Hcp效应子的正常表达、分泌功能以及VflT6SS2介导的杀菌活性所必需。AL536_RS29525可能转录后水平影响VflT6SS2的功能表达。     

AFLP技术在细菌学分型和流行病学调查中的应用

基于DNA水平的生物遗传多态性分析大大丰富了生物多样性的发现和分析。近年来,对于基因多态性的研究及基因标记技术迅速发展。目前用于多态性分析的方法主要有限制性片段长度多态性(RFLP)、随机引物PCR(RAPD)、脉冲场凝胶电泳(PFGE)、细菌的核糖体基因分型(Ribotyping)、多位点序列分析(MLST)以及扩增片段长度多态性(AFLP)等[1]。这些方法所得到的多态性,都是运用染色体DNA通过限制性内切酶消化或/和PCR扩增的方法,根据带型中一些特征条带的存在或缺失来比较。带型的差异是实验菌株之间遗传距离的直接反映,因而认为这些带型是…