膀胱肿瘤经尿道切除术后复发相关因素分析

目的分析经尿道膀胱肿瘤切除术（TUR-Bt）后影响膀胱肿瘤复发的相关因素。方法应用Logistic回归方法和COX比例风险模型，对126例行TUR-Bt术的膀胱肿瘤患者的一般情况和临床特征等17项指标与复发时间进行统计分析，并绘制Kaplan-Meier复发风险曲线。结果肿瘤基底（Hr=2．825）、肿瘤分期（Hr=2．223）、肿瘤数目（Hr=2．203）和术后膀胱灌注化疗（Hr=0．465）是与TUR-Bt术后肿瘤复发显著相关的因素。结论评价TUR-Bt术后膀胱肿瘤复发情况可参考上述4个因素。     

Ki67反义核酸对裸鼠人肾癌细胞移植瘤生长及凋亡的影响

目的 观察Ki67基因反义寡核苷酸(ASODNs)对裸鼠人肾癌细胞移植瘤生长及凋亡的影响。方法 BALB／C-nu裸鼠接种入肾癌786-0细胞,治疗组瘤体注射ASODNs(10 mmol／g),连续4 d。对照组注射RPMI 1640培养基。药物处理后第3、6、12天每次处死小鼠4只,取瘤组织检测肿瘤体积;免疫组织化学、Western blot检测Ki67表达;脱氧核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)法检测凋亡。结果ASODNs处理组小鼠肿瘤体积缩小,与对照组比较差异有显著性(P<0.01);肿瘤Ki-67抗原表达率、Ki-67蛋白定量均降低,与对照组比较差异均有显著性(P<0.01);肿瘤细胞凋亡率增加,与对照组比较差异均有显著性(P<0.01)。结论Ki67 ASODNs能有效抑制裸鼠入肾癌细胞移植瘤生长并促进其凋亡。     

抗人肾癌G250单克隆抗体的制备及其功能鉴定

目的 大量制备、纯化抗人G250单克隆抗体(G250-MeAb),并鉴定其与G250合成多肽及细胞天然抗原的结合特异性.方法 将抗人G250杂交瘤细胞接种BALB/C小鼠腹腔,大量制备G250-McAb.采用正辛酸-硫酸铵沉淀法获得粗制抗体,然后经蛋白A亲和层析柱纯化抗体.采用荧光激活细胞分类术及免疫组织化学法鉴定G250-McAb与抗原结合特异性.结果 成功制备抗人G250-MeAb,腹水经纯化后,获得了高纯度抗人G250单克隆抗体,蛋白浓度达4.78 g/L.荧光激活细胞分类术及免疫组织化学结果 显示G250-McAb与G250表达阳性的Ketr-3细胞特异性结合,而不与G250表达阴性的ACHN细胞结合.结论 成功制备并纯化G250-McAb,为进一步开展G250-McAb介导的肾癌诊断、治疗奠定了基础.     

RNAi人端粒酶逆转录酶基因腺病毒表达载体的构建及对肾癌细胞生长的抑制作用

目的 构建表达端粒酶逆转录酶(hTERT)基因小干扰RNA(siRNA)腺病毒载体,观察其对肾癌细胞系Ketr-3生长抑制作用.方法 将病毒Ad-hTERT体外感染人肾癌细胞系Ketr-3,分别用结晶紫染色、噻唑蓝(MTT)法检测其对细胞生长的影响,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定hTERT基因mRNA的表达水平,免疫组织化学检测hTERT抗原的表达.结果 结晶紫、MTT结果表明:在MOI=50时,Ad-hTERT感染的Ketr-3细胞发生明显病变;MOI=50的Ad-hTERT感染Ketr-3细胞后,在第3、5、7天细胞存活率分别为(92.3±1.2)%、(82.0±1.0)%和(72.0±1.0)%,与对照组比较差异有统计学意义(P《0.05);RT-PCR结果表明:病毒Ad-hTERT感染Ketr-3细胞3d后,hTERT mRNA表达是对照组的(50.5±1.7)%,差异有统计学意义(P《0.01);免疫组织化学结果表明:Ad-hTERT处理组的hTERT抗原表达较对照组显著减少.结论 转录hTERT基因siR-NA的重组腺病毒载体为肾癌基因治疗提供了新的工具.     

Fas配体诱导淋巴细胞凋亡与肾癌免疫攻击作用

目的　探讨Fas配体 (FasL)诱导淋巴细胞凋亡与肾癌免疫攻击作用的关系。　方法　采用免疫组化技术检测 4 4例肾癌组织FasL表达及肿瘤周围浸润淋巴细胞 (TIL)凋亡情况 ,并应用肾癌细胞株 786 0、GRC 1与JurkatT淋巴细胞共培养检测T细胞凋亡率。SP法检测Ki6 7表达 ,评价肾癌预后。　结果　 (1) 4 4例肾癌组织FasL表达阳性率 4 6 .5 % ,高于正常肾组织的 2 3.2 % ,差别有显著性意义 (P <0 .0 1)。随肾癌分期增加 ,FasL表达阳性率增加。肾癌FasL表达率与Ki6 7表达率呈显著正相关 (r =0 .93,P <0 .0 1)。 (2 )肾癌组织TIL凋亡率为 33.9% ,高于正常肾组织的3.5 % ,差别有显著性意义 (P <0 .0 1)。肾癌FasL表达率与TIL凋亡率呈显著正相关 (r =0 .96 ,P <0 .0 1)。 (3) 786 0FasL表达率 18.6 % ,GRC 1表达率 2 .3% ,二者差别有显著性意义 (P <0 .0 1)。Ju rkat细胞与 786 0细胞共培养的凋亡率 14 .9% ,与GRC 1共培养的凋亡率 1.3% ,二者差别有显著性意义 (P <0 .0 1)。中和抗体NOK 2中和 786 0细胞FasL后 ,与之共培养的Jurkat细胞凋亡率显著减少 (P <0 .0 1)。　结论　肾癌组织FasL表达增高 ,以此诱导淋巴细胞凋亡 ,实现对宿主的免疫攻击。     

表达端粒酶逆转录酶siRNA的溶瘤腺病毒对裸鼠肾癌移植瘤的治疗作用

Objective To investigate the antitumor effect of oncolytic adenovirus armed with small interference RNA targeting hTERT gene for renal cancer therapy. Methods Nude mice were divid-ed randomly into 4 groups (8 mice/group),and were treated by intratumoral injections of ZD55-hTERT ( an oncolytic adenovirus armed with small interference RNA targeting hTERT gene) ,ZD55-EGFP ( an on-colytic adenovirus) and Ad-hTERT (replication-defective adenovirus armed with small interference RNA targeting hTERT gene) with three consecutive daily at 7 × 108 pfu/day or treated with PBS as a control. The expression of E1A and hTERT, and apoptosis of tumor xenografts were assessed by immunohistochemi-cal technique at the 7th day after injections. The tumor volume was measured at the 50th day after injec-tions. Results The tumor volume in ZD55-hTERT treatment group ( 124.1±27.5) was significantly less than that in ZD-EGFP (499.8±77.1 ) and Ad-hTERT ( 609.0±102.5 ) treatment groups. The E 1A pos-itive expression in ZD55-hTERT treatment group was significantly higher than that in Ad-hTERT treatment group. The hTERT positive expression in ZD55-hTERT treatment group was significantly lower than that in Ad-hTERT treatment group. ZD55-hTERT treatment of tumor xenografts resulted in an increased apoptotie cell death as compared with ZD55-EGFP and Ad-hTERT treatment. Conclusion The antitumor effect of ZD55-hTERT was more potent than oneolytie adenovirus ZD55-EGFP and Ad-hTERT.     

Ki-67启动子转录调控结构与功能研究

目的 观察Ki-67核心启动子调控元件对转录调控的影响.方法 根据Ki-67启动子结构软件分析结果,对Ki-67核心启动子(-223～+30)内的5个调控区域,包括(+13～+30)及4个潜在Sp1结合位点(-198～-172)、(-170～-144)、(-63～-37)和(-14～+12)进行内部缺失,目的片段缺失的Ki-67核心启动子插入pGL3-Basic载体,构建报告基因重组体质粒.将重组体分别转染肿瘤Hela、SW1990、SGC-7901、A549细胞株,使用双荧光素酶报告基因检测系统测定其转录活性,并与Ki-67核心启动子质粒pGLBK2+转录活性比较.结果 缺失(+13～+30)的启动子重组体质粒在4种肿瘤细胞的转录功能均有显著提高,分别达到缺失前的1.2、2.0、1.7、1.4倍.缺失潜在Sp1结合位点的4个启动子重组体在4种肿瘤细胞的转录功能均有显著降低,其中缺失(-170～-144)后转录活性最小,在4种肿瘤细胞中分别降至未缺失前的16.2%、10.4%、6.7%、12.2%.结论 Ki-67启动子(+13～+30)区包含负性调控元件,对其缺失后形成的新的Ki-67核心启动子(-223～+12)是更好的调控肿瘤基因治疗的启动子.(-198～-172)、(-170～-144)、(-63～-37)和(-14～+12)可能存在潜在的Sp1顺式作用元件,其中-170～-144区域的顺式作用元件最为重要.     

肿瘤Ki-67抗原HLA-A2限制性细胞毒性T淋巴细胞表位的鉴定

目的 鉴定Ki-67抗原HLA-A2限制性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位,为制备肿瘤疫苗提供依据.方法 根据BIMAS和SYFPEITHI数据库对人Ki-67抗原CTL表位综合评分结果,合成7条候选肽.通过T2-肽结合实验检测候选肽与HLA-A2分子亲和力;通过酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测HLA-A2阳性CTL细胞分泌IFN-γ能力,评价候选肽免疫原性.结果 合成的候选肽及阳性对照肽HIV-1 pel 476-484纯度均超过95%.T2-肽结合实验结果显示280～288位置Ki-67氨基酸序列LQGETQLLV与HLA-A2分子结合力较强,其能够诱导特异性CTL活化.结论 LQGETQLLV(280～288)是Ki-67抗原的HLA-A2限制性CTL表位.     

表达端粒酶逆转录酶siRNA的溶瘤腺病毒对裸鼠肾癌移植瘤的治疗作用

目的 观察表达针对端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的小干扰RNA(hTERT siRNA)的溶瘤腺病毒(ZD55-hTERT)抑制肾癌移植瘤生长作用.方法 荷肾癌裸鼠随机分4组,每组8只.瘤体内分别注射ZD55-hTERT、增殖缺陷型腺病毒(Ad-hTERT)、溶瘤腺病毒ZD55-EGFP及磷酸盐缓冲液(PBS),每次注射病毒7×108pfu/只,连续注射3 d.注射后第7天,每组处死3只取肿瘤组织,免疫组织化学检测肿瘤hTERT、E1A表达及凋亡.第50天时处死动物测量肿瘤体积.结果 ZD55-hTERT、Ad-hTERT、ZD55-EGFP及PBS处理组肿瘤体积(mm3)分别为:124.1±27.5、609.0±102.5、499.8±77.1、1552.1±206.4,ZD55-hTERT处理组与各组之间差异有统计学意义(P<0.01).Ad-hTERT处理组肿瘤无E1A表达,ZD55-hTERT处理组E1A大量表达,表明病毒复制.ZD55-hTERT处理组肿瘤hTERT表达显著低于Ad-hTERT处理组,凋亡细胞阳性率均显著高于Ad-hTERT处理组.结论 表达hTERT siRNA的溶瘤腺病毒ZD55-hTERT具有更强的抑制肾癌生长作用.