16SrRNA基因序列分析用于诊断病原性细菌感染初步研究

目的建立一种可适用于多种病原菌检测的方法,以提高病原学诊断率,有利于传染病的病原学监测。方法细菌16SrRNA基因通用引物对直接从血液、尿液、脑脊液标本中提取的细菌DNA进行PCR扩增,并对16SrRNA基因扩增产物进行克隆和序列分析。结果检测了28份临床标本,16SrRNA基因序列分析与尿液细菌培养结果不完全吻合;血液和脑脊液的16SrRNA的检出率均高于细菌培养。结论16SrRNA基因检测分析和细菌培养均具有良好的诊断效果,而针对16SrRNA基因的PCR直接扩增核酸并进行序列分析可对分离培养阴性的标本进行有效的补充诊断,可检测到多种病原菌如肠球菌,大肠杆菌,表皮葡萄球菌,牛链球菌,猪链球菌,布鲁氏菌,表皮葡萄球菌和脑膜炎球菌等,为疾病的诊断提供良好的线索。     

一种快速检测患者血液标本猪链球菌方法的研究

目的建立一种快速检测患者血液标本中猪链球菌的方法。方法收集患者血液标本。提取细菌金基因组DNA；根据猪链球菌6个特异基因设计引物，采用PCR技术对这些基因进行检测，并对PCR扩增阳性的基因产物进行序列分析验证，并分析该方法诊断猪链球菌病的特异性和敏感性。结果取唾液链球菌等6种链球菌进行验证，该检测方法的特异性为100％。模拟标本（细菌含量〉10^3个／ml）的敏感性为100％，血培养阳性病人标本的敏感性为100％。通过对90份血培养阴性临床标本的检测，9份PCR结果阳性，序列分析结果证实扩增片段为目的基因。结论该方法灵敏、特异、快速。可直接用于患者血液标本的猪链球菌特异性基因的检测，为猪链球菌感染的早期诊断提供实验室依据。     

男性泌尿生殖道感染患者奈瑟菌属菌种的基因检测

目的:检测从男性泌尿生殖道感染患者分离的奈瑟菌属菌种的基因并探讨非淋病奈瑟菌的致病性以及奈瑟菌属菌种感染的实验室诊断方法。方法:用聚合酶链反应及核苷酸序列测定方法,检测男性泌尿生殖道感染患者泌尿生殖道分离的奈瑟菌属菌种的淋病奈瑟菌核酸扩增荧光检测试剂的反应及其染色体上16SrRNA基因、淋病奈瑟菌DNA甲基转移酶基因orf1、隐蔽性质粒基因cppB及外膜蛋白基因nspA。结果:男性泌尿生殖道感染患者泌尿生殖道分离的14株奈瑟菌属菌种经16SrRNA基因检测鉴定为淋病奈瑟菌2株、粘液奈瑟菌3株、灰色奈瑟菌3株、干燥奈瑟菌2株、微黄奈瑟菌2株、嗜乳糖奈瑟菌1株、多糖奈瑟菌1株,其中淋病奈瑟菌核酸扩增荧光检测试剂阳性反应的9株、cppB阳性反应1株、orf1阳性反应5株、nspA阳性反应3株。16SrRNA基因检测与常规细菌学方法鉴定结果比较,两者的符合率85.7%。结论:引起男性泌尿生殖道感染的非淋病奈瑟菌缺乏cppB,大多数菌株缺乏淋病奈瑟菌毒力相关的orf1与nspA并且可在淋病奈瑟菌核酸扩增荧光检测试剂检测中显示阳性反应,从而造成淋病奈瑟菌鉴定与淋病诊断的误诊以及其他奈瑟菌感染的漏诊。在疑似奈瑟菌属菌种感染的实验室检查中联合使用常规细菌学方法与基因检测方法,可有助于提高奈瑟菌属菌种鉴定及其感染诊断的准确率。     

奶牛粪便分离的伊氏李斯特菌伊氏亚种基因组序列测定及其分子特征分析

目的 了解某奶牛场奶牛粪便中李斯特菌的携带情况及其分离株的遗传特征。方法 用ISO 11290方法分离196份奶牛粪便样本中的李斯特菌,对分离的伊氏李斯特菌进行全基因测序,用MEGA6.0构建系统发育树,网站在线比对分析伊氏李斯特菌株的毒力基因、耐药基因及前噬菌体等。结果 196份奶牛场养殖的奶牛粪便样本中有9份样本为李斯特菌阳性,其中3株为伊氏李斯特菌伊氏亚种,6株为英诺克李斯特菌,分离率分别为1.53%和3.06%。3株伊氏李斯特菌伊氏亚种分离株具有包括LIPI-1和LIPI-2在内的绝大部分致病性李斯特菌毒力相关基因,携带一个不完整的前噬菌体及22个耐药相关基因。结论 养殖场奶牛粪便中携带伊氏李斯特菌伊氏亚种。对伊氏李斯特菌伊氏亚种分离株的全基因组、毒力基因、耐药基因、前噬菌体基因等遗传特征分析,为进一步分析其致病性提供了参考。     

安徽省马鞍山市分离的枸橼酸杆菌的分子分型

目的 了解中国安徽省马鞍山市分离到的枸橼酸杆菌的分子流行病学特征。方法 2007-2011年从安徽省马鞍山市的腹泻患者粪便、食品和食品加工者肛拭分离到62株枸橼酸杆菌,包括13株弗氏枸橼酸杆菌、41株杨氏枸橼酸杆菌和8株布氏枸橼酸杆菌。所有菌株用Xba Ⅰ酶切进行脉冲场凝胶电泳（PFGE）分型和扩增7个管家基因的多位点序列分型（MLST）分析。结果 PFGE将62株枸橼酸杆菌分成43个带型（PTs）,MLST将其分成53个ST型别（STs）。CITX01.CN0039是PFGE的优势带型,由2007-2008年间从食品和腹泻患者粪便分离的7株杨氏枸橼酸杆菌组成。53个ST型别分成5个ST序列群,ST序列群39个优势菌株来自腹泻患者粪便、食品和食品加工者肛拭分离的枸橼酸杆菌。从腹泻患者粪便、食品和食品加工者肛拭分离得到的枸橼酸杆菌具有相同的PTs和STs。结论 在食品和人群中监测枸橼酸杆菌对预防和控制枸橼酸杆菌引起的腹泻是必要的。     

弗氏枸橼酸杆菌CF74的T6SS影响FliC的表达和分泌

目的 研究弗氏枸橼酸杆菌CF74的T6SS基因组岛功能。方法 构建弗氏枸橼酸杆菌CF74的T6SS基因组岛的精确缺失突变株(CF74T6SS)。对弗氏枸橼酸杆菌CF74和其突变株CF74T6SS的全菌蛋白和上清蛋白进行提取,并进行2-DE分析。结果 在CF74T6SS全菌蛋白中,有4个蛋白表达上调,42个蛋白表达下调,并且FliC的表达下调十分明显;在CF74T6SS的培养上清中,有27个蛋白表达上调,36个蛋白表达下调,并且FliC、FlgK和FliD的表达下调十分明显。结论 弗氏枸橼酸杆菌CF74的T6SS可以影响FliC蛋白的表达和分泌。     

福氏痢疾杆菌2b血清型菌株基因组中SfII和SfX前噬菌体整合位点及排列方式研究

目的 研究福氏痢疾杆菌2b血清型菌株中SfII和SfX前噬菌体整合位点及排列方式.方法 根据2b血清型菌株基因组中SFII和SfX前噬菌体可能的整合位点及排列方式,设计引物,对50株2b血清型菌株进行PCR扩增,并对扩增产物测序,根据扩增和测序结果判断噬菌体的整合位点和排列方式.结果 在2b血清型菌株中,SfII和SfX前噬菌体前后相连,整合于宿主菌染色体proA和yaiC基因间的thrW tRNA基因上;以SfII在前,SfX在后,或SfX在前,SfII在后两种方式排列;而以后一种方式为主,在共50株检测菌株中,有49株为此方式.结论 福氏痢疾杆菌血清型相关噬菌体的整合位点及排列方式,对研究福氏痢疾杆菌血清型转换及血清型相关噬菌体的整合机制具有重要意义.     

16s rDNA序列分析在腹泻粪便标本菌群分析应用

目的应用16s rDNA序列分析方法,对临床实验室没有分离到已知病原菌的腹泻病人粪便标本进行菌群分析,为腹泻病人的病原学诊断提供线索。方法根据细菌16s rDNA保守区序列设计通用引物,以腹泻病人粪便标本中的总DNA为模板,PCR扩增16s rDNA片段。将获得的片段克隆入T载体进行测序,与数据库中发表序列的进行比对,判断标本中细菌的种类和比例;PCR扩增常见的五类致病性大肠杆菌的特征基因应用于排除诊断。结果在3份粪便标本中,大肠杆菌为优势菌群(所占比例分别为84%、65%和81%);其他种群细菌为拟杆菌属(Bacteroides)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)和普雷沃氏菌属(Prevotella)等;实验室常规培养方法没有分离到常见的五类致病性大肠杆菌;PCR扩增没有发现常见的五类致病性大肠杆菌的特征基因。结论引起三例病人腹泻的病原菌可能是一种新的大肠杆菌;16s rDNA序列分析方法可应用于腹泻粪便标本菌群分析,为常规的病原培养方法提供补充,对疾病的诊断提供线索。     

实时荧光定量聚合酶链反应检测血清2型猪链球菌的研究

目的 基于TaqMan-MGB探针实时荧光定量聚合酶链反应(Real.time PCR)技术,建立针对血清2型猪链球菌的快速检测方法.方法 针对血清2型猪链球菌的csp2J基因序列,应用Beacon Designer 7.0,设计了引物和TaqMan-MGB探针,建立Real-time PCR检测方法;把目的 片段克隆...