携带人OCT4A基因的慢病毒载体的构建及其稳定转染K562白血病细胞株的建立

本研究旨在构建共表达人OCT4A与绿色荧光蛋白（GFP）慢病毒载体pLVX-OCT4A-ZsGreen1,并通过感染获得稳定表达重组质粒的白血病K562细胞系,观察OCT4A在其中的表达。根据Gen Bank数据库提供的OCT4A mRNA序列,合成编码mRNA基因的特异性引物序列,通过RT-PCR技术扩增出OCT4A全长片段,克隆至pCR-Blunt载体。将OCT4A DNA片段酶切回收后克隆至经EcoR1酶切线性化的慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1,构建pLVX-OCT4A-ZsGreen1慢病毒重组质粒,利用测序鉴定所构建的重组载体是否正确。经三质粒包装系统包装后获得高滴度慢病毒颗粒并感染人白血病细胞系K562,通过流式细胞仪分选获得稳定表达的白血病细胞系,应用Real-time PCR和Western blot方法分别检测稳定转染细胞系的OCT4A mRNA和OCT4A蛋白表达。应用CCK-8法和平板细胞克隆形成试验测定OCT4A对K562细胞增殖能力的影响。结果表明,经限制性内切酶检测及基因测序证实成功构建了携带OCT4A基因的重组慢病毒;包装病毒颗粒超速离心后病毒滴度达（1.43±0.25）×10^8U/ml;病毒感染K562细胞后经流式细胞仪分选获得GFP＋细胞,实时定量PCR及Western blot证实病毒感染后OCT4A基因及蛋白的表达可有效上调;CCK-8法及平板集落形成试验显示病毒感染的K562细胞体外增殖活性明显升高,与对照组相比均有统计学差异（P〈0.05）。结论：成功构建了表达OCT4A基因的慢病毒载体,并且获得可稳定上调OCT4A表达的K562细胞株。     

UC-MSC联合利妥昔单抗及甲强龙对系统性红斑狼疮免疫炎性易栓状态的影响作用

目的初步探讨脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells,UC-MSC）联合利妥昔单抗（rituximab,美罗华）与甲强龙对系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）患者免疫炎性易栓状态的干预作用。方法8例SLE患者经肾活检确诊为狼疮性肾炎。予SLE活动指数（SLEDAI积分）评价病情活动程度;流式细胞术（FCM）监测B细胞清除、T细胞亚群及炎症介质表达水平;酶联免疫吸附法（ELISA）检测抗心磷脂抗体（ACA）、狼疮抗凝物（LA）水平;以磁珠法检测血凝常规、血浆D二聚体（D-D）、抗凝血酶（AT）等。结果随访第1个月临床症状明显改善,CD19和CD20降至＂0＂;至第3个月全组SLEDAI评分〈4分,Th1（IFN-γ）、Th2（IL-4）及CD11b、CD25水平均接近正常;随访至1年上述指标维持在正常值内。结论利妥昔单抗联合UC-MSC所具有的靶向作用,能有效清除外周血致病性B细胞,恢复Th1/Th2免疫平衡状态,减少炎症因子释放,促进机体免疫重建,恢复凝血-抗凝系统平衡,从而改善机体免疫炎性易栓状态。     

嵌合抗原受体T细胞免疫治疗T细胞恶性肿瘤研究进展北大核心CSCD

复发难治T细胞恶性肿瘤目前尚无特效药物,临床前研究及临床研究证实嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)治疗可能成为复发难治T细胞恶性肿瘤最有前景的免疫治疗手段之一,但靶向T细胞肿瘤的CAR-T尚面临巨大挑战:①无特异性靶抗原:理想状态下,靶抗原应仅表达于肿瘤细胞上,而在正常T细胞上不表达,对于T细胞恶性肿瘤来说,大多数靶抗原在正常T细胞和肿瘤T细胞均表达;②难以区分正常T细胞和肿瘤T细胞:CAR-T细胞疗法需要从患者体内分离出正常T细胞,否则很可能导致产品污染或肿瘤细胞的CAR修饰[1];③CAR-T细胞自相残杀:靶抗原在CAR-T细胞上的表达会导致CAR-T细胞自相残杀,而靶向正常T细胞表达的抗原会引起T细胞免疫缺陷,进而导致严重的机会性感染[2]。本文对CAR-T细胞治疗T细胞恶性肿瘤的临床前及临床研究综述如下。     

CD19嵌合抗原受体T细胞制备条件优化及其体内外杀伤作用研究北大核心CSCD

目的优化小鼠CD3^(+)T细胞体外刺激活化体系及最佳感染时间,构建小鼠CD19嵌合抗原受体T细胞(mCD19CAR-T),并验证其在体内外的杀伤效果.方法磁珠分选纯化小鼠的脾脏CD3^(+)T细胞,在可溶性抗CD3/CD28抗体、佛波酯+离子霉素、包被抗CD3/CD28抗体3种不同条件下刺激培养,分别于8、24、48和72h流式细胞术检测细胞活性情况;用包含小鼠CD19抗体的scFv质粒转染Plat-E细胞,包装逆转录病毒后感染活化的CD3^(+)T细胞,制备鼠特异性的CD19嵌合抗原受体T细胞(mCD19 CAR-T).mCD19 CAR-T细胞在体外与B淋巴瘤细胞株A20细胞共培养,利用流式细胞术检测其对A20细胞的靶向杀伤效果;建立淋巴瘤小鼠模型,体内输注mCD19CAR-T细胞,检测CAR-T细胞的体内杀伤和分布情况.结果包被抗CD3/CD28抗体的刺激活化效果最佳,且在刺激后24~48h具有较好的细胞活性;抗mCD19的逆转录病毒感染CD3^(+)T细胞效率[(32.27±7.56)%]稳定,制备的mCD19 CAR-T细胞可特异性杀伤A20肿瘤细胞,48 h时A20细胞凋亡率为24.3%;体内检测发现输注mCD19CAR-T细胞第6天即可检测到脾脏中CD19+细胞比例[(1.83±0.58)%]显著降低,到建模后第12天骨髓和脾脏中CD19+细胞清除更为显著,与A20细胞组相比差异具有统计学意义[脾脏:(0.36±0.04)%对(47.00±13.46)%,P<0.001;骨髓:(1.82±0.29)%对(37.30±1.44)%,P<0.0001].且mCD19 CAR-T细胞在外周血、脾脏和骨髓中均有分布,GFP+CD3^(+)CAR-T细胞比例分别为(2.90±1.12)%、(4.96±0.80)%、(13.55±1.56)%,以骨髓中占比最高.结论获得优化的CD3^(+)T细胞活化刺激体系和最佳感染时间,稳定构建了抗mCD19 CAR-T细胞,并在体内外验证其具备良好的杀伤能力.     

大剂量地塞米松导致胸腺细胞损伤的作用研究

本研究观察大剂量地塞米松对胸腺上皮细胞（thymic epithelial cells,TEC）的结构和功能的影响.将6-8周龄的C57BL/6雄性小鼠随机分为地塞米松（20 mg/kg）处理组以及正常对照组.给药后第5d,取小鼠新鲜胸腺标本,应用常规病理学和免疫荧光技术观察TEC的形态学变化,并用流式细胞术分析胸腺内细胞总数、TEC和各胸腺细胞亚群数量的变化,同时应用实时定量PCR分析与TEC功能相关的基因的表达情况.结果表明,与正常对照组相比,大剂量地塞米松处理组TEC结构被破坏、胸腺内总细胞数减少（P＜0.05）;胸腺细胞各亚群构成发生变化,其中双阳性（double positive,DP）胸腺细胞数急剧降低（P＜0.05）;与胸腺修复功能相关的因子Foxn1和IL-22的表达量较正常对照小鼠明显增加（P＜0.05）.结论：大剂量地塞米松的使用可导致TEC的结构和功能破坏,并诱导与TEC修复相关的基因的表达水平上调.     

白血病干细胞的新型标志蛋白IL1RAP杂交瘤细胞的制备及其分泌单克隆抗体的检测

本研究旨在制备针对白血病干细胞表面标志蛋白IL1RAP（IL-1receptoraccessoryprotein）的特异性单克隆抗体并对其进行鉴定。用重组人IL1RAP作为抗原免疫BALB／c小鼠,通过常规杂交瘤技术将免疫后的小鼠脾细胞与SP2／0细胞经PEG融合,筛选阳性杂交瘤细胞株。分别应用EusA和Westernblot法对杂交瘤细胞上清中分泌抗体进行抗体类型、滴度和敏感性检测。分离人外周单个核细胞,检测所得抗体对细胞内源性抗原的特异性。结果表明,获得了8株可稳定分泌IL1RAP单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别为3H6E10、486A6、8G1185、9E9F2、10D8A7、1C7H7、1D7G11和2D3D3;抗体类型鉴定为IgG1／K型;分泌的单克隆抗体能特异性识别单个核细胞表达的IL1RAP。结论：本实验成功制备了可稳定分泌IL1RAP单克隆抗体的杂交瘤细胞及其特异性的IL1RAP单克隆抗体,为将来有效清除体内白血病干细胞提供了新途径。     

多发性骨髓瘤细胞B7-H3分子的表达与预后和骨质破坏的关系

本研究探讨多发性骨髓瘤细胞株及多发性骨髓瘤患者CD138＋骨髓瘤细胞中B7-H3的表达水平及其临床意义。应用流式细胞术及RT-PCR法检测3种骨髓瘤细胞株（RPMI8226、U266和H929）表面B7-H3的表达水平及45例（46例次）多发性骨髓瘤患者CD138＋细胞中B7-H3的表达水平,分析其与临床预后及生存时间相关性。结果表明：①B7-H3在骨髓瘤细胞株RPMI8226、U266中高表达,阳性率分别为（92.30±1.1）%和（79.03±1.2）%,在H929细胞中未见明显表达,约占（4.26±0.2）%;RT-PCR检测到RPMI8226及U266细胞株B7-H3 mRNA产物,在H929细胞株未检测到其产物。②外源IL-6刺激细胞株未见B7-H3分子的上调。③在多发性骨髓瘤患者中,初诊者B7-H3阳性率为（48.58±33.593）%,缓解者为（22.16±18.853）%,复发者为（57.65±28.296）%,初诊与缓解、缓解与复发者的B7-H3阳性率差异有显著统计学意义（P=0.023,P=0.004）。④B7-H3高表达较低表达的患者具有更多的骨质破坏（P=0.027）,血清钙离子水平显著升高（2.3144±0.44619 vs 2.0948±0.2504;P=0.046）。结论：B7-H3的表达可能与多发性骨髓瘤的预后呈负相关,与骨髓骨质破坏程度呈正相关。     

人骨髓基质细胞的培养及鉴定

目的:探讨骨髓基质细胞的分离、体外培养方法,为基因治疗提供载体细胞.方法:采用密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离人骨髓进行体外培养扩增,用倒置显微镜观察细胞形态学特征并用流式细胞仪鉴定其CD90表达.结果:分离培养的骨髓基质细胞似成纤维状,原代细胞呈集落生长,并可表达CD90,传代后细胞形态较一致,且随着传代次数的增加CD90表达越高,第3代可达94.31%.结论:骨髓基质细胞可通过体外培养纯化获得,随着传代次数增加,纯度越高,该方法是一种较理想的骨髓基质细胞培养方法.     

miR-194-2-192簇与MDM2在多发性骨髓瘤中的表达及临床意义

目的:目的:探讨miR-194-2-192簇与鼠双微体基因2(MDM2)在多发性骨髓瘤(MM)中的表达及临床意义。方法:留取MM患者骨髓标本21例,应用嵌合荧光法(SYBR?GreenⅠ)的实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测miR-194-2-192簇和MDM2的表达情况,并用2-△△Ct方法进行相对定量分析。以10例健康体检者作为对照。结果:miR-194-2-192簇在MM患者中的表达显著低于对照者,而MDM2的表达显著高于对照组(均P<0.05),且均与ISS临床分期有关(均P<0.05)。miRNA-192与MDM2呈显著负相关(r=-0.353,P=0.035)。经过不同治疗后,MM患者中硼替佐米治疗者的MDM2表达水平显著低于VAD(长春新碱+阿霉素+地塞米松)治疗者(P<0.05)。结论:MDM2是miR-192的直接靶基因。miRNA-194-2-192簇低表达和MDM2高表达可能是MM发病发展的重要因子。