2009年中俄满洲里—后贝加尔斯克口岸地区鼠类及其携带病原的调查研究

〔目的〕了解中俄满洲里—后贝加尔斯克口岸地区鼠类及其携带病原情况。〔方法〕2009年8月,在满洲里和后贝加尔口岸地区采用夹日法和夹夜法捕鼠。采集满洲里地区鼠类脏器和血样本,用聚合酶链反应PCR方法检测肝、脾组织中的鼠疫耶氏菌、土拉弗氏菌和莫氏立克次体核酸;用逆转录RT-PCR方法检测肺组织的汉坦病毒核酸;分别用酶链免疫吸附试验(ELISA)和胶体金免疫层析方法检测血标本中的汉坦病毒和鼠疫耶氏菌、土拉弗氏菌、莫氏立克次体抗体。〔结果〕2009年8月,在中方满洲里口岸地区捕鼠7种53只,总捕鼠率6.63%,优势鼠种为长爪沙鼠、达乌尔黄鼠、黑线毛足鼠;在俄方后贝加尔斯克口岸地区捕鼠10种158只,总捕鼠率19.75%,狭颅田鼠、黑线仓鼠和黑线毛足鼠为优势鼠种。满洲里口岸鼠脏器样本中未检测到病原核酸,血标本中3份汉坦病毒抗体阳性。〔结论〕中俄满洲里-后贝加尔斯克口岸地区鼠类构成不同,中方鼠类中存在汉坦病毒感染。     

云南省一株版纳病毒的分离和鉴定

目的 对2008年在云南省勐腊县采集的蚊虫进行版纳病毒(BAV)分离和鉴定.方法 2008年7月在勐腊县南嘎村人房和畜圈采集蚊虫标本,用细胞培养法进行虫媒病毒分离并鉴定,测定分离到的BAV第5、8及11节段序列,利用MEGA4软件进行系统进化分析.结果 共采集到蚊虫7种1731只,分离到1株导致C6/36细胞产生规律病变的分离物,经血清学和分子生物学鉴定为BAV,系统进化分析显示第8节段和中国分离株关系最近,而第11节段和越南分离株关系最近.结论 系统进化分析提示该BAV毒株可能与越南分离株之间发生了基因重配.     

广西北流市分离到基因Ⅰ型流行性乙型脑炎病毒

目的从广西流行性乙型脑炎(乙脑)监测点之一的北流市分离乙脑病毒并研究其基因分型。方法2006年在广西北流市采集蚊虫标本,在C6/36和BHK-21细胞上进行病毒分离,对病毒分离物进行多种虫媒病毒抗体的酶联免疫吸附试验,获得的乙脑病毒进行E基因扩增、测序和基因分型。结果在北流市采集骚扰阿蚊2588只和三带喙库蚊230只,分61批进行处理,获得3个病毒分离物,酶联免疫吸附试验与乙脑抗体反应,E基因测序后基因分型显示为基因Ⅰ型乙脑病毒。结论从广西蚊虫标本分离到基因Ⅰ型乙脑病毒。     

中国滇西北地区分离流行性乙型脑炎病毒的分子特征研

目的 对中国滇西北地区分离的流行性乙型脑炎(乙脑)病毒进行分子特征研究,了解与云南省内其他地区病毒株的差异.方法 用RT-PCR的方法扩增滇西北地区分离的13株乙脑病毒PrM、E片段和3'非编码区,对扩增产物进行序列测定.用Clustal 1.8X、DNASTAR、GENEDOC等生物学软件进行核苷酸序列和系统进化分析.结果 基于PrM和E基因核苷酸序列的系统进化显示,滇西北分离的13株乙脑病毒中有12株属于基因Ⅰ型,1株为基因Ⅲ型;12株基因Ⅰ型乙脑病毒与云南省其他地区分离的病毒株处于不同分支;和云南省其他地区分离株之间E基因核苷酸序列差异度为0.2%～13.9%;3'非编码区存在两种核苷酸缺失情况,基因Ⅰ型毒株在终止密码子后出现3处缺失,而基因Ⅲ型毒株只有1处缺失.结论 滇西北地区乙脑病毒分离株以基因Ⅰ型为主,E基因核苷酸序列与云南省其他地区分离株差异不明显;基因Ⅰ型毒株在3'非编码区存在3处缺失,而基因Ⅲ型毒株则只有1处缺失.     

喀什0507JS32病毒的分离鉴定

2005年7～8月，在喀什地区采集蚊虫进行病毒分离，从当地居民家畜圈采集的一组库蚊分离到0507JS32病毒，该病毒对C6／36细胞致病变，而对Vero细胞不致病变。电镜观察显示，完整病毒颗粒呈球形，直径55nm，无包膜，衣壳表面壳粒结构明显。基因组核酸电泳显示基因组为12节段双链RNA（double stranded RNA，dsRNA）。利用辽宁病毒（Liaoning virus，LNV）第12基因片段特异性引物对病毒RNA进行RT-PCR扩增，PCR产物进行序列测定，所得核酸序列进行BLAST比较，结果显示，与LNV病毒第12基因片段核酸序列同源性大于89％，证实该病毒为LNV病毒。     

伯氏疏螺旋体分型多重实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立一种检测伯氏疏螺旋体的分型多重实时荧光定量PCR方法,可对3种致病基因型伽氏疏螺旋体B.garinii、阿氏疏螺旋体B.afzelii、狭义伯氏疏螺旋体B.burgdorferi sensu stricto检出并分型。方法针对3种基因型菌株的外膜蛋白osp C基因,在保守序列设计通用引物并分别设计型特异Taqman探针,3条探针分别标记FAM、Texas Red和CY5荧光报告基团,建立和优化多重实时荧光定量PCR反应体系,检测其敏感性和特异性。结果建立的多重荧光定量PCR的最低检测值为B.garinii 40copies/μl、B.afzelii 5.17copies/μl和B.burgdorferi sensu stricto 37.8copies/μl,通过检测立克次体、土拉弗朗西斯菌无交叉反应,检测100只游离蜱与常规PCR结合测序结果分型一致,说明本方法有较好的灵敏性和特异性。结论该方法能快速检测伯氏疏螺旋体并同时分型,为莱姆病的诊断提供新方法。     

新型冠状病毒双重荧光RT-PCR检测方法

目的为快速检测新型冠状病毒,防控疫情的输入,建立一种快速的双重实时荧光RT-PCR检测方法。方法对WHO公布的单重实时荧光RT-PCR检测引物和探针进行重新设计和优化,建立双重荧光RT-PCR反应体系,分别采用羧基荧光素(FAM)和绿色荧光蛋白(VIC)荧光基团标记探针,实现双基因的同时检测。结果经优化的双重实时荧光RT-PCR方法有较好的灵敏度和特异性,对阳性对照质粒检测灵敏度为31拷贝/μl,检测健康和普通发热人员咽拭子以及流感病毒无交叉反应。结论建立了双重实时荧光RT-PCR快速检测方法,提高检测效率和准确度的同时降低了成本,可用于新型冠状病毒的快速应急检测。     

多种蚊媒病毒x—TAG悬浮芯片复合检测方法的建立

建立多重检测东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、基孔肯亚病毒、登革病毒、日本脑炎病毒、黄热病毒、西尼罗病毒、圣路易斯脑炎病毒、版纳病毒、布尼亚病毒、裂谷热病毒的悬浮芯片方法。将十二种蚊媒病毒分为3组,每组使用标记有不同anti—TAG的上游引物及标记有生物素的下游引物对分别构建多重PCR体系,PCR产物与偶联了x—TAG的编码磁性微球进行杂交,最后利用Bio—plex100分析系统对12种蚊媒病毒分别进行单一、多重液相芯片检测。将平均荧光强度的判定阈值定为背景对照的3倍,多批次实验均能对十二种单一病毒样本和混合病毒样本进行准确鉴定,未出现交叉反应,表明该方法特异性较好。敏感性测试结果显示本检测方法具有高灵敏度。通过利用偶联有TAG及生物素的引物对,成功建立了可同时检测12种蚊媒病毒的液相芯片检测技术平台。该平台对于病原体的检测具有较好的应用前景。     

通用型基因悬浮芯片检测生物恐怖细菌的方法研究

目的 建立快速、高通量的基因悬浮芯片检测方法,用于生物恐怖病原体的快速筛检.方法 选择保守的细菌16 S rDNA序列,并针对炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis,B.a)、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis,Y.p)、布鲁菌属(Brucella spp.,Bru)、土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis,F.t)和类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei,B.p)等5种生物恐怖细菌设计种(属)特异性探针,经16 S rDNA通用引物341A、519B扩增基因组DNA,用基因悬浮芯片方法进行检测,并对方法的灵敏度、特异度、重复性、检测能力进行验证.结果 经16 S rDNA通用引物扩增,特异性探针杂交检测,能将样本细菌鉴定到属水平,同属菌出现交叉反应;检出限分别为类鼻疽伯克霍尔德菌1.5 pg/μl,布鲁菌属20 ps/μl,炭疽芽孢杆菌7 pg/μl,土拉弗朗西斯菌0.1 pg/μl,鼠疫耶尔森菌1.1 pg/μl;15次重复检测各探针变异系数(CV)为5.18%～17.88%,具有较好的重复性;方法可正确检出模拟白色粉末样本中炭疽芽孢杆菌和鼠疫耶尔森菌.结论 建立了通用型基因悬浮芯片检测体系快速高通量筛查生物恐怖细菌的方法.     

通用型基因悬浮芯片检测生物恐怖细菌的方法研究

Objective To develop a fast, high-throughput screening method with suspension array technique for simultaneous detection of biothreat bacteria. Methods 16 S rDNA universal primers for Bacillus anthracis, Francisella tularensis, Yersinia pestis, Brucella spp. and Burkholderia pseudomallei were selected to amplify corresponding regions and the genus-specific or species-specific probes were designed. After amplification of chromosomal DNA by 16 S rDNA primers 341A and 519B,the PCR products were detected by suspension array technique. The sensitivity, specificity, reproducibility and detection power were also analyzed. Results After PCR amplification by 16 S rDNA primers and specific probe hybridization,the target microorganisms could be identified at genus level, cross reaction was recognized in the same genus. The detection sensitivity of the assay was 1.5 pg/μl (Burkholderia pseudomallei),20 pg/μl (Brucella spp.), 7 pg/μl (Bacillus anthracis), 0.1 pg/μ1 (Francisella tularensis), and 1.1 pg/μl (Yersinia pestis),respectively. The coefficient of variation for 15 test of different probes was ranged from 5.18% to 17.88%,it showed good reproducibility. The assay could correctly identify Bacillus anthracis and Yersinia pestis strains in simulated white powder samples. Conclusion The suspension array technique could be served as an opening screening method for biothreat bacteria rapid detection.