肝硬化患者血浆刺激内皮产生一氧化氮的实验研究

目的 研究肝硬化患者血浆能否刺激血管内皮细胞产生一氧化氮。方法 分别用正常人血浆和肝硬化患者血浆刺激人脐静脉血管内皮细胞,以硝酸还原酶法测定细胞培养上清NO浓度,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定血管内皮细胞NO(eNOs)mRNA水平。结果肝硬化患者血浆组NO浓度显著高于正常人血浆组(P≤0.01);门静脉高压症患者血浆处理组eNOS mR-NA水平较正常人血浆组增高,且有时间依赖性,正常人血浆处理样品的各个时间点其RNA水平没有明显差异。结论 肝硬化患者血浆本身可刺激血管内皮细胞产生NO。     

中国旱獭干扰素α家族基因在真核细胞和原核细胞中的表达

目的将不同基因型中国早獭干扰素α（IFNα）基因在真核和原核细胞中进行表达，检测其生物学活性，以期利用克隆的中国旱獭IFN在动物模型上探索慢性乙型肝炎有效的IFN治疗方案和策略。方法利用分子克隆技术将14个不同亚型的中国旱獭IFNα家族基因亚克隆到真核表达载体，将中国旱獭IFNα5亚型基因亚克隆到原核表达载体。病毒保护实验检测表达产物的生物学活性，比较不同基因亚型IFNα生物学活性的差异，分析中国旱獭IFNα生物学活性的种属特异性。结果l4个基因亚型中国旱獭IFNα中，8个功能基因亚型真核表达产物有生物学活性，而6个假基因亚型产物没有生物学活性，8个功能基因亚型真核表达产物生物学活性仔在差异，且其活性都受种属特异性限制。原核表达纯化产物具有较好的生物学活性。结论中国旱獭IFNα家族基因能在真核和原核细胞中表达，表达产物具有生物学活性。本研究为在中国旱獭乙型肝炎病毒感染模型上探索IFN治疗策略奠定了实验基础。     

乙型肝炎病毒核心质粒的构建及原核表达

目的构建乙型肝炎病毒核心区原核表达质粒并进行原核蛋白表达、纯化和鉴定。方法应用基因工程技术将编码截短型乙型肝炎病毒核心蛋白(HBcAg1～144aa)的基因片段装入原核表达载体pRSET-B内，在宿主菌B121(DE3)plysS内进行诱导表达，运用Ni—NTA方法纯化日的蛋白。采用酶联免疫吸附实验(ELISA)及Western blot检测蛋白的灵敏度和特异性。结果成功地构建了含截短型乙型肝炎病毒核心区基因的质粒，并纯化得到了分子量约为19．5kD的目的蛋白：结论本方法所获得的重组截短型乙型肝炎病毒核心抗原(1～144a)纯度高，免疫反应性强：     

PPM1A和P-Smad2在原发性肝癌中表达及意义研究

目的探讨肝癌及癌旁组织中P-Smad2蛋白与PPM1A的表达及意义。方法采用免疫组织化学技术检测31份肝癌（HCC）、25份癌旁组织及13份非癌性肝组织中P-Smad2蛋白和PPM1A的表达。结果①癌旁和病理分级小于Ⅱ级的癌组织中PPM1A表达以核为主，胞浆表达弱或不表达，病理分级大于Ⅲ级及以上的癌细胞中则以胞浆表达为主。正常、慢性肝炎和肝硬化组织中，PPM1A表达以核为主，胞浆无表达，差别有统计学意义（P〈0．05）。②P-Smad2在正常肝细胞、慢性肝炎、肝硬化、癌旁和病理分级Ⅰ-Ⅱ级的癌组织中表达以胞核和胞浆明显，胞浆表达主要聚集在核周，病理分级分级Ⅱ-Ⅲ级及以上的癌组织中，P-Smad2表达则以核为主，差别有显著性（P〈0．05）。③PPM1A和P-Smad2在癌组织的表达部位呈现负相关性（r=-0．345，P=0．001）。结论PPM1A与P-Smad2在肝癌组织的胞核和胞浆表达转位及强度与其组织病理改变有密切关系，二者可能通过其相互作用。共同参与肝癌的发生发展机制。     

高亲和力抗乙型肝炎表面抗原单克隆抗体制备及检测变异HBsAg方法的建立

目的制备抗乙型肝炎表面抗原(HBsAg)单克隆抗体,建立检测变异HBsAg的方法。方法用血源HB-sAg免疫BALB/c小鼠,制备可以识别变异HBsAg的抗-HBs单抗。筛选出可以较好识别变异HBsAg的单抗mAb1,优化该抗体ELISA检测HBsAg的方法,与2种HBsAg检测试剂比较检测变异HBsAg的能力。对6份临床样品进行检测及序列分析,以证实方法的可靠性。结果经过筛选,得到1种可以较好识别包括G145R在内的大多数变异HB-sAg的单抗。检测变异HBsAg的能力优于市售HBsAg诊断试剂。结论制备的单抗可以用于ELISA检测变异HB-sAg,减少HBsAg变异株的漏检率。     

G145R变异乙型肝炎表面抗原诱导的抗体性质研究

乙型肝炎表面抗原（HBsAg）变异可导致抗原性改变。HBsAga决定簇最常见的变异位点是G145R。G145R变异可能改变原来的抗原表位，并形成新的抗原表位。本研究探讨G145RHBsAg能否刺激机体产生抗体及免疫应答的情况。     

中国旱獭去唾液酸糖蛋白受体糖基结合域的原核表达与多克隆抗体的制备

目的：构建中国旱獭去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）H1和H2亚基糖基识别域（CRD）的原核表达质粒，体外表达纯化后制备多克隆抗体。方法：RT-PCR扩增出中国旱獭肝组织中ASGPR CRDH1和CRDH2 cDNA，将其克隆至原核表达载体pRSET-B中，在大肠杆菌BL21（DE3）pLysS内诱导表达。用纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体，并采用酶联免疫吸附试验、Western blot及免疫组织化学检测抗体的灵敏度和特异性。结果：成功构建了中国旱獭去唾液酸糖蛋白受体H1和H2亚基糖基识别域原核表达质粒pRSET-B.CRDH1和pRSET-B.CRDH2，目的蛋白可以高效表达，用其免疫BALB/c小鼠获得了高效价的特异性多克隆抗体。结论：首次成功表达了中国旱獭去唾液酸糖蛋白受体H1和H2亚基糖基识别域多肽，且纯度高，免疫原性强，用其免疫小鼠获得的多克隆抗体特异性好、效价高，为在HBV感染模型-中国旱獭体内进行肝脏疾病的靶向治疗奠定了实验基础。     

PPM1A蛋白的表达纯化及鼠多克隆抗体制备研究

目的 表达、纯化PPM1A-His融合蛋白及制备鼠多克隆抗体.方法 将pBEX1-PPM1A-His原核表达质粒在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS内进行诱导表达,用纯化的PPM1A-His融合蛋白免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体,并用ELISA、免疫组化和免疫荧光检测抗体的灵敏度和特异性.结果 成功表达并纯化了PPM1A-His融合蛋白,纯化后纯度可达90%;ELISA法测定抗体效价为1:100 000;免疫组化和免疫荧光结果显示所制备的抗体可特异性检测肝和肝癌细胞的PPM1A.结论 获得的PPM1A鼠多克隆抗体有较高的效价和特异性,为PPM1A在肝癌的相关研究打下了基础.     

螺杆菌感染与NF-κB p65蛋白表达相关性在人食管癌发生中的意义

目的研究人食管癌是否存在螺杆菌感染及其与NF-κB p65蛋白的关系,从而探讨在人食管癌发生中的意义。方法随机收集食管癌标本40例和正常食管标本10例,采用聚合酶链反应(PCR)扩增螺杆菌16S rRNA,随机选4例测序及同源比较。阳性者再扩增幽门螺杆菌(H.pylori, Hp)的特异基因相对分子质量(M_r)26×10~3的种特异性抗原和相关功能基因(CagA,VacA)。并采用免疫组化法检测食管癌组织中NF-κB p65蛋白的表达情况。结果32.5%(13/40)的食管癌组织中发现有螺杆菌16S rRNA基因存在,正常人食管组织无一例阳性。4例测序及同源比较,食管癌组织中螺杆菌序列与H.pylori的16S rRNA序列有99%～100%同源性。阳性标本均扩增出Hp特异基因M_r 26×10~3种特异性抗原,但仅2例扩增出CagA基因,3例扩增出VacA基因。免疫组化法染色显示,16S rRNA阳性的食管癌组织中NF-κB p65蛋白表达率为100%(13/13),而16S rRNA阴性食管癌组织表达率仅占18.5%(5/27),二者差异有统计学意义(P<0.01)。结论食管癌患者食管组织存在螺杆菌感染,该螺杆菌可能为Hp。螺杆菌感染导致食管黏膜NF-κB p65蛋白表达的增加,可能在食管癌生成中作为信号传导机制之一。     

筛选出一株可识别多种变异HBsAg的单克隆抗体及其应用

目的 制备筛选可识别变异表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)的单克隆抗体(monoclonal antibody, mAb).用筛选出的单克隆抗体建立检测变异HBsAg的ELISA实验方法.方法 用血源HBsAg免疫Balb/c小鼠,通过杂交瘤细胞融合技术制备抗-HBs单克隆抗体.不同单克隆抗体包被酶标反应孔,检测真核细胞表达的野生及变异HBsAg,了解各种单克隆抗体的反应模式 .筛选出可以较好识别变异HBsAg的单克隆抗体Hb1,优化该抗体ELISA检测HBsAg的方法,与 8种HBs Ag检测试剂比较检测变异HBsAg的能力.结果 经过筛选,得到一种可以较好识别包括G145R在内大多数变异HBsAg的单克隆抗体.检测变异HBsAg的能力优于市售HBsAg 诊断试剂.结论 用本实验制备的单克隆抗体可以用于ELISA检测变异HBsAg,减少HBsAg变异株的漏检率.