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1.
目的观察替比夫定体外对乙型肝炎病毒(HBV)复制的抑制作用。方法HBV复制子pHBV1.3质粒转染Huh7细胞,在转染细胞培养液中加入不同浓度的替比夫定,然后在不同时间段观察替比夫定的抗病毒作用。用ELISA检测培养上清中HBsAg、HBeAg水平,用荧光定量PCR(FQ—PCR)检测培养上清中HBVDNA拷贝数,用Southern blot分析转染细胞中HBV复制中间体。结果替比夫定减少了培养上清中HBsAg、HBeAg的表达及HBVDNA拷贝数,抑制了转染细胞中HBV复制中间体的形成。替比夫定对HBV复制子体外复制的抑制作用依赖于药物浓度及作用时间。结论替比夫定在体外对HBV有较强的抑制作用。  相似文献   
2.
通用表达型T载体的构建与真核基因的快速克隆表达   总被引:1,自引:0,他引:1  
目的:为简化PCR产物真核表达载体构建步骤,构建真核表达型T载体,并对其特性及表达效率进行分析.方法:限制性内切酶EcoR V酶切真核表达载体pcDNA3,回收线性化质粒片段与dTTP 70℃退火,构成T克隆载体并回收纯化.将增强绿色荧光蛋白基因(EGFP)和中国旱獭a干扰素基因(cwIFNA5)分别扩增后直接克隆到新构建的表达型T载体,转化感受态细菌,挑选阳性菌并制备质粒瞬时转染真核细胞,荧光显微镜观察EGFP的表达,病毒保护试验检测中国旱獭a干扰素的生物学活性.结果:外源基因EGFP和cwIFNA5克隆进该载体后可以进行高效表达,基因转染72 h后,荧光显微镜观察到EGFP基因转染细胞荧光阳性率在80%以上,荧光强度高:病毒保护试验表明cwIFNA5转染细胞培养上清干扰素效价高达1∶600.结论:本研究构建的表达型T载体可用于基因的克隆之外,还可以直接用于基因的高效表达作蛋白质功能分析.  相似文献   
3.
目的:建立新的土拨鼠α干扰素(IFN-α)基因分型方法,分析急性和慢性土拨鼠肝炎病毒(Woodchuck hepati-tis virus,WHV)感染的土拨鼠肝细胞中不同型别的IFN-α基因表达谱及其意义。方法:利用已知序列和基因型的土拨鼠IFN-α基因克隆质粒,建立基于土拨鼠IFN-α基因序列的限制性片段长度多态性的土拨鼠IFN-α基因分型方法。PolyIC体外刺激正常土拨鼠外周血单个核细胞(PBMC),调查正常土拨鼠PBMC受PolyIC刺激后IFN-α基因的表达谱。提取急性和慢性土拨鼠肝炎病毒感染的土拨鼠肝组织mRNA,RT-PCR扩增土拨鼠IFN-α基因,分子克隆后调查急性和慢性感染的土拨鼠肝细胞中IFN-α基因表达谱。结果:建立了土拨鼠IFN-α基因限制性片段长度多态性分型方法。急性和慢性感染的土拨鼠肝细胞中IFN-α基因的表达谱明显不同于正常动物的表达谱,假基因表达所占比例大。结论:新建立的土拨鼠IFN-α基因分型方法可用于分析土拨鼠不同组织中IFN-α的基因表达谱。  相似文献   
4.
目的构建人鸟苷结合蛋白1(hGBP-1)真核表达质粒,观察hGBP-1体外对柯萨奇病毒B3(CVB3)和乙型肝炎病毒(HBV)的抑制作用。方法长链RT-PCR扩增全长hGBP-1编码区基因,克隆到pCR2.1TA克隆载体,再亚克隆到pcDNA3.1(-)真核表达载体。体外转染HepG2细胞和Hela细胞,Western blot检测hGBP-1的表达。然后分别观察转染细胞中hGBP-1对HBV体外复制子pHBV1.3和CVB3的抑制作用。ELISA检测共转染HepG2细胞培养L清HBsAg、HBeAg水平;Southern blot检测细胞HBVDNA复制中间体。TCID50试验检测Hela细胞培养物中CVB3感染量。结果成功构建hGBP-1真核表达质粒,能在HepG2细胞和HeLa细胞进行高效表达。该质粒与pHBV1.3共转染HepG2细胞,不能抑制HBV复制,HBsAg、HBeAg及HBV DNA复制中间体水平与对照相比都无明显变化。转染质粒在HeLa细胞上对CVB3复制有明显的抑制作用,CVB3感染量显著降低,尤其在低剂量病毒攻击时能完全抑制CVB3复制。结论hGBP-1可能在IFN介导的抗CVB3中起重要作用,但不能抑制HBV的复制。  相似文献   
5.
活动性巨细胞病毒感染与反复自然流产的关系探讨   总被引:2,自引:0,他引:2  
目的探讨活动性人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)感染与反复自然流产(recurrent spontaneous abortion,RSA)的关系.方法采集反复自然流产孕妇和正常产前体检孕妇外周血,分离外周血单个核细胞(PBMCs)和血浆,分别用免疫荧光法和实时定量PCR检测HCMV pp65抗原和HCMV DNA,并比较2种方法的一致性.结果 65例RSA患者HCMV pp65抗原有20例阳性,阳性率30.8%,50例正常体检孕妇 HCMV pp65抗原有4例阳性,阳性率8.0%,2组孕妇HCMV活动性感染率有显著性差异(χ^2=8.87,P<0.01).孕妇HCMV pp65抗原阳性率升高,孕妇流产几率增加(χ^2=7.53,P<0.01). 免疫荧光法和实时定量PCR有较好的一致性(92.3%).结论反复自然流产孕妇 HCMV活动性感染率显著高于正常孕妇,HCMV pp65抗原检测也许可作为RSA早期诊断指标之一.  相似文献   
6.
目的对土拨鼠白细胞介素15(woodchuck interleukin 15,wIL-15)分子进行克隆、表达并鉴定其活性,为进一步研究IL-15在嗜肝病毒感染中的作用以及评价IL-15用于治疗慢性HBV感染奠定基础。方法用IL-15的保守引物将wIL-15基因克隆、测序并进行分析,构建wIL-15的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达,分离纯化后用淋巴细胞增殖试验检测其生物学活性。结果wIL-15的完整编码序列为489nt(与其他哺乳动物IL-15编码序列的同源性高达78%~87%),编码162AA长度的前体蛋白(与其他哺乳动物IL-15蛋白的同源性高达70%~80%),其信号肽为N端的48AA,成熟蛋白由114AA组成。土拨鼠IL-15与灵长动物IL-15的同源性高于啮齿动物。带有His-tag的成熟蛋白,可以在大肠杆菌中表达,分离纯化后,可以刺激Con A活化的小鼠脾细胞和土拨鼠PBMC增殖(其SI值可高达10以上),并存在明显的剂量依赖性。结论(1)wIL-15与其他哺乳动物IL-15高度同源,并且与灵长类动物的IL-15更接近。(2)wIL-15可以在大肠杆菌中表达,并在纯化后能刺激小鼠和土拨鼠淋巴细胞增殖,表现出较好的生物学活性。  相似文献   
7.
慢性乙型肝炎是长期影响人类健康的一大难题,全球约有3.5亿人血清中携带乙型肝炎病毒表面抗原。我国的感染情况严重,携带率占总人口的10%以上。目前临床治疗慢性乙型肝炎的主要方法依然是干扰素(IFN)结合核苷类药物,虽然患者对重组IFN的应答率有所增加,但还是不能令人满意。慢性乙型肝炎患者对IFN治疗出现应答差异的原因还不十分清楚。为此,我们检测了慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞(PBMC)诱导抗病毒IFN-α的能力,并分析α干扰素治疗前后不同应答者的α干扰素受体1(IFNAR1)的表达,试图从机体自身的免疫细胞来探讨出现差异的机制。  相似文献   
8.
目的建立检测外周血单个核细胞α干扰素受体1(IFNAR1)及检测诱导表达α干扰素(IFN-α)的方法,评价慢性丙型肝炎患者外周血单个核细胞(PBMC)细胞免疫功能与α干扰素治疗的关系。方法Poly IC体外刺激正常对照组和慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染组患者PBMC,利用病毒保护试验研究干扰素治疗前后患者PBMC表达的干扰素抗病毒生物学活性差异;IFN-α治疗前后,RT-PCR检测慢性丙型肝炎患者不同干扰素应答组患者PBMC IFNAR1表达的变化。结果对照组PBMC分泌的干扰素活性显著高于慢性丙型肝炎患者应答组患者(P<0.001);干扰素应答组患者PBMC分泌的干扰素活性随治疗时间延长而增加,治疗1个月后显著高于无应答组患者PBMC分泌的干扰素活性(P<0.01),后者始终处于低下水平;IFN-α治疗期间干扰素应答组患者PBMC IFNAR1水平从治疗前的高表达而逐渐减少,正常对照和干扰素无应答组患者PBMC IFNAR1的表达始终较低。结论慢性HCV感染患者的细胞免疫功能受损,不能正常表达IFN-α,但应答组患者经干扰素治疗后IFN-α表达能力逐渐恢复;干扰素无应答组患者PBMC IFNAR1表达受到严重抑制;慢性丙型肝炎患者PBMCIFN-α活性检测及IFNAR1检测结果也许可以作为干扰素治疗预后的判断指标。  相似文献   
9.
目的 构建乙型肝炎病毒(HBV)感染性复制子表达载体,建立HBV体外复制细胞模型,分析其复制特性及对抗病毒药物的敏感性.方法 以质粒pHBV-dimer为模板,采用PCR结合限制性酶切的方法分步将1.3拷贝HBV基因组克隆到pCR2.1载体.将构建的phBV1.3质粒转染Huh7细胞,ELISA检测不同时间HBsAg、HBeAg的表达.Southern Blot和Northem Blot分析HBV复制中间体、转录物.并利用该细胞模型进行阿德福韦抗病毒研究.结果 成功构建了HBV感染性复制子表达质粒,该质粒上HBV基因能在Huh7细胞中进行有效复制、转录和表达,并能在体外短期传代12 d.阿德福韦能体外抑制该HBV复制子的复制,抑制程度依赖于药物浓度.结论 新构建的HBV感染性复制子表达载体可介导高水平病毒复制,可用于HBV复制机制和抗病毒等方面的研究.  相似文献   
10.
目的:分析丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)1b 型非结构蛋白3(non-structure protein 3, NS3)丝氨酸蛋白酶区序列的变异规律及影响意义。方法使用基因型别特异性引物,通过巢式 PCR 的方法扩增119例慢性 HCV 1b 型患者血清中 HCV NS3区。对 PCR 产物进行测序后获得 NS3区核苷酸及氨基酸序列。分析119例 HCV 1b 型 NS3区序列的同源性及种系进化,分析 NS3丝氨酸蛋白酶区的变异情况及重要功能位点的突变情况。结果湖北地区 HCV 1b 型与 HCV 1b 型标准株及亚洲地区序列同源性较高,核苷酸序列同源性为85.94%及87.68%,氨基酸序列同源性可达96.83%及92.39%,而与欧美地区1b 型同源性较低,核苷酸序列同源性均为85.57%,氨基酸序列同源性分别为92.17%及93.38%。进化树分析提示湖北地区序列与中国其他地区序列亲缘性较接近,而与日本、东南亚地区及欧美地区的1b 型亲缘性较远。 NS3丝氨酸蛋白酶区185个氨基酸内有34个位点有氨基酸突变,但其重要的功能区包括催化酶底物特异性结合位点以及 Zn2﹢结合位点在所有序列中均高度保守,无一例发生突变。结论对湖北地区 HCV 1b型 NS3丝氨酸蛋白酶区的变异规律及生物学意义的研究进一步丰富和完善了对 HCV 1b 型基因组变异情况的认识。为了解 HCV1b 型在中国地区的进化过程提供一定理论基础。  相似文献   
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