携带单纯疱疹病毒tk基因的人肝癌特异性逆转录病毒载体的构建(英文)

目的构建携带单纯疱疹病毒ｔｋ基因（ＨＳＶｔｋ）的人肝癌特异性逆转录病毒载体．方法用ＳａｌＩ酶切除逆转录病毒载体ｐＭＮＳＭ内部的ＳＶ４０启动子成为ｐＭＮＭ；从真核表达载体ｐＢＰＧｋｔｋ质粒中用ＢａｍＨＩ酶游离带有磷酸甘油酸激酶基因（ｐｇｋ）启动子调控的ＨＳＶｔｋ片段，克隆到ｐＭＮＭ的ＰＬ位点上，构建成普通型ｐＭＮＰｔｋ逆转录病毒载体；从ｐＧＥＭ．７ＺＡＦＰｅ质粒中用ＥｃｏＲＩ酶游离人甲胎蛋白基因增强子核心序列，克隆到ｐＭＮＰｔｋ的ｐｇｋ启动子上游，构建成人肝癌特异型ｐＭＮＡＰｔｋ逆转录病毒载体．结果酶切鉴定ｐＭＮＰｔｋ和ｐＭＮＡＰｔｋ载体构建正确．结论该载体对肝癌特异性前药转换基因治疗有重要意义．     

用生物反应器制备Namalva细胞干扰素的实验研究

<正> 干扰素(IFN)主要通过有关细胞按正中心法则合成一类特殊蛋白质来阻止病毒的复制过程,同时又作用于T、B淋巴细胞和NK细胞来发挥免疫调节作用。我室从八十年代初对Namalwa细胞IFN进行了系列化研究,包括制备工艺、IFN纯化、核酸检测、抗肿瘤、抗病毒和临床试用。目前采用日本MSJ-U_3T型30立升带有“自动生物传感系统”的装置,通过该装置,可对细胞生长条件如T(温度)、pH、DO(溶氧)、AGIT(搅拌)     

肾细胞癌浸润淋巴细胞的杀伤肿瘤活性测定及表型分析

采用Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅ方法从１９例ＲＣＣ中成功地分离到１７例ＴＩＬ，经１９天培养，ＴＩＬ数量平均达１．０４×１０~（１１）个细胞。杀伤自体肿瘤活性为５７．８７±５．８８％，对Ｒａｊｉ细胞的杀伤活性为３７．３９±１０．８８％，两组间比较差异有非常显著性（Ｐ＜０．０１）。明显高于外周血淋巴细胞（ＰＢＬ）的杀伤肿瘤活性（２２．３９±８．８４％）。ＴＩＬ中ＣＤ_３和ＣＤ８细胞分别为６９．９３±６．８０％及４０．２１±６．８０％，均明显高于ＰＢＬ中的ＣＤ３和ＣＤ_８细胞（Ｐ＜０．０１）。ＴＩＬ对Ｋ５６２细胞的杀伤活性为２６．８９±１２．７９％，提示活化的ＴＩＬ有显著的杀伤肿瘤活性，且对自体肿瘤细胞的杀伤活性更为显著，其杀伤活性主要由Ｔ淋巴细胞介导。     

中期因子转录物及其蛋白在肝细胞癌中的定位与表达研究

目的了解中期因子 (Midkine,MK)转录物及其蛋白产物在肝细胞癌 (hepatocellularcarci noma ,HCC)中的定位情况与表达特点。方法应用原位杂交、免疫组织化学染色等方法对 33例人HCC组织、10例良性肝肿瘤组织及其配对瘤旁肝组织进行了MKmRNA及蛋白的定位与表达研究。结果免疫组织化学结果与原位杂交结果具有一致性 (χ2 =0 5 0 0 ,P >0 0 5 )。MK在HCC组织中呈高表达。MKmRNA及蛋白的阳性信号聚集于HCC细胞质。在HCC细胞外组织中亦有MK表达 ,尤以血管密集处明显。HCCMK表达率与肝癌组织学类型、分级等临床病理学特点无相关性。结论HCC在mRNA和蛋白水平上表达MK增加 ,并可能与促进HCC血管生成有关     

腺病毒介导的VEGF启动子-胸苷激酶表达系统对肝癌细胞的选择性杀伤作用

目的:构建携带受血管内皮生长因子(VEGF)启动子调控的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-tk)的重组腺病毒载体,并探讨该重组腺病毒对体外培养的肝癌细胞的特异性杀伤活性.方法:采用AdEasy System 构建携带受VEGF启动子或巨细胞病毒(CMV)启动子调控tk基因表达的AdVEGF-tk和AdCMV-tk,这两种重组腺病毒载体在293细胞中包装、扩增后,体外感染正常肝细胞系L02和肝癌细胞系HepG2,并用不同浓度的丙氧鸟苷(GCV)处理后以MTT法检测受染细胞的增殖情况.结果:AdVEGF-tk的病毒滴度为1×1010 pfu/ml,AdCMV-tk为5×1010 pfu/ml.L02细胞感染AdVEGF-tk后对GCV的敏感性无明显改变,而HepG2细胞感染AdVEGF-tk后对GCV的敏感性明显增加,在感染复数(MOI)为100并用50 μg/ml GCV处理时,则有90％ 以上HepG2细胞被杀死;而AdCMV-tk可杀死95％ HepG2细胞和80％ 以上L02细胞.结论:VEGF启动子调控的HSV-tk基因表达可特异性地杀死肝癌细胞,同时对正常肝细胞几无影响.     

识别肿瘤血管内皮细胞的嵌合性T细胞受体的构建与鉴定

近年来发展了一种新的肿瘤免疫治疗策略 ,即将能够特异性识别并结合肿瘤细胞表面抗原、或受体的抗体或配体 ,与T细胞受体胞内成分融合成嵌合性 T细胞受体 (chimeric Tcell recepter,c TCR) ,赋予 T细胞持久的、预先决定的新配体识别特异性 ,转染 c TCR的细胞毒 T淋巴细胞 (cytotoxic Tlym phocyte,CTL )选择性地靶向和杀伤肿瘤细胞 [1 ] 。鉴于血管内皮生长因子受体在恶性肿瘤组织和正常组织中表达完全不同 [2 ,3] ,本研究采用重叠延伸技术构建一种能识别肿瘤血管内皮细胞的 c TCR,为进一步研究其功能提供实验基础。1　材料和方法1.…     

腺病毒介导的KDR启动子-胸苷激酶系统对血管内皮细胞的选择性杀伤作用

目的研究腺病毒介导的KDR启动子-胸苷激酶系统对血管内皮细胞的选择性杀伤作用.方法应用PCR克隆出人KDR基因启动子序列-225 bp～+127 bp,以AdEasy system为载体,构建携带受KDR启动子或CMV启动子调控tk基因表达的2种重组腺病毒质粒pAdKDR-tk和pAdCMV-tk,在293细胞中包装、扩增后,体外感染表达KDR的脐静脉血管内皮细胞系HUVEC和不表达KDR的肝癌细胞系HepG2,并给予不同浓度的丙氧鸟苷(GCV)处理,5 d后收集存活细胞并计数.结果产生的病毒滴度均为5×109pfu/ml.在MOI为100、GCV为50μg/ml条件下,AdKDR-tk转染HUVEC后细胞生存率下降(31.49%±6.42%),AdKDR-tk转染HepG2后细胞生存率为76.57%±3.49%,而转染AdCMV-tk的2细胞系生存率均显著下降,细胞生存率分别为22.24%±3.77%(HUVEC)和26.53%±6.84%(HepG2).结论KDR基因启动子可调控HSV-tk在血管内皮细胞中特异性表达,为进一步开展靶向肿瘤血管内皮的自杀基因治疗研究奠定了基础.     

异常凝血酶原酶免疫测定法作为肝癌标志物的研究

新近越来越多的临床研究资料表明,异常凝血酶原对原发性肝细胞癌(HCC)具有相当的诊断意义。本文采用酶免疫测定法检测1026例各种良恶性疾病患者血浆异常凝血酶原,进一步探讨异常凝血酶原作为 HCC 标志物的应用价值。     

小鼠Alb e／p序列与肝癌细胞核蛋白之间的相互作用

目的：研究肝癌组织特异性基因治疗的机理。方法：从小鼠肝细胞、肝癌细胞和黑色素瘤细胞中分别提取核蛋白组分和胞浆蛋白，分别与小鼠白蛋白增强子／启动子（Ａｌｂｅ／ｐ）、白蛋白增强子（Ａｌｂｅ）和白蛋白启动子（Ａｌｂｐ）结合。结果：Ｂａｎｄ－Ｓｈｉｆｔ试验和竞争试验发现某些肝癌细胞核蛋白组分能与Ａｌｂｅ／ｐ特异结合，其中与Ａｌｂｅ和Ａｌｂｐ特异结合的核蛋白在不同的组分中，而肝癌细胞胞浆蛋白和黑色素瘤细胞核蛋白不能与Ａｌｂｅ／ｐ结合。结论：提示肝癌细胞核中能与Ａｌｂｅ和Ａｌｂｐ作用的核蛋白是应用Ａｌｂｅ／ｐ调控目的基因于肝癌细胞中特异表达的基础。